高不饱和脂肪酸对离体大黄鱼头肾巨噬细胞营养生理及免疫力的影响

论文摘要

本研究借助离体细胞培养技术,研究高不饱和脂肪酸在鱼类免疫应答中的作用,回答有关高不饱和脂肪酸对鱼类免疫调控的部分机制问题。主要研究内容包括:（1）大黄鱼头肾巨噬细胞体外模型的建立。（2）花生四烯酸（ARA, 20:4n-6）对离体大黄鱼头肾巨噬细胞营养生理及免疫力的影响。（3）二十碳五烯酸（EPA, 20:5n-3）和二十二碳六烯酸（DHA, 22:6n-3）对离体大黄鱼头肾巨噬细胞营养生理及免疫力的影响。主要研究结果如下:（1）通过优化Percoll密度梯度离心技术,从大黄鱼头肾组织中分离纯化巨噬细胞,并优化细胞培养条件。对所分离细胞进行形态学分析、普通光镜和电镜超微结构观察以及细胞功能验证实验。实验结果表明:相比34%/51% Percoll梯度分离液,31%/45%梯度的Percoll分离液分离巨噬细胞效率更高。经瑞氏-吉姆萨染色分析,初分细胞中巨噬细胞/单核细胞的比例高达42%,过夜培养后使细胞贴壁,冲洗掉未贴壁细胞,在所形成的细胞单层中,巨噬细胞/单核细胞的纯度可达到90%以上。细胞单层分别置于18摄氏度、22摄氏度以及26摄氏度无CO2恒温培养箱中,于添加5%FBS的L15培养基中培养120h,MTT细胞活力检测发现22摄氏度条件下培养的细胞活力显著高于其他温度条件。普通光镜和电镜观察到大黄鱼头肾巨噬细胞具有伪足发生和较强的吞噬能力、胞浆中富含线粒体以及吞噬小泡。当施加LPS刺激后,细胞呼吸爆发活性随LPS浓度以及孵育时间变化而变化。孵育3h后,LPS协同PMA可诱导巨噬细胞超氧阴离子（O2-）的产生。然而,孵育24h后,LPS协同PMA显著抑制细胞O2-的生成（P<0.05）。添加LPS复合PMA或人类肿瘤坏死因子α（hrTNF-α）或者钙离子载体A23187无法有效刺激大黄鱼头肾巨噬细胞产生较多的一氧化氮（NO）。（2）将不同浓度ARA（5μM、25μM、50μM、100μM、200μM和1000μM）以脂肪酸-胎牛血清白蛋白（FA-BSA）的形式添加到培养基中,孵育12h、24h和36h。实验结果表明,细胞活力随着ARA浓度的升高以及孵育时间的延长而下降,尤其在孵育36h后,高浓度的ARA（200μM和1000μM）同对照组相比显著降低了细胞活力（P<0.01）,同时高浓度的ARA （200μM和1000μM）可以显著诱导细胞脂质过氧化物的生成（P<0.05）。细胞吞噬能力随ARA浓度的升高呈先上升后降低的趋势,其中25μM和100μM的ARA显著促进了细胞吞噬能力,而1000μM的ARA则显著抑制细胞吞噬能力（P<0.01）。100μM的ARA可以显著提高大黄鱼头肾巨噬细胞的O2-生成量（P<0.05）。ARA能显著提高分泌型磷脂酶A2（sPLA2）的生成量（P<0.01）,但是其浓度的增加并不随ARA浓度的改变而变化。细胞培养上清液中前列腺素E2 （PGE2）浓度随ARA浓度的增加而显著增加（P<0.01）,最大值出现在1000μM ARA处理组中。然而,ARA浓度对白细胞介素1β（IL-1β）的生成量却无显著影响,且处理组培养液中IL-1β的浓度都处于一个较低的水平（约6pg/ml左右）。（3）分别将不同浓度EPA或DHA（5μM、25μM、50μM、100μM、200μM和1000μM）以FA-BSA的形式添加到培养基中,孵育一定时间。实验结果表明,细胞活力随着EPA或DHA浓度的增大以及孵育时间的延长而下降,分别孵育24h和36h后,细胞活力随脂肪酸浓度升高明显下降。其中,200μM和1000μM的EPA或DHA处理组细胞活力均显著低于对照组（P<0.01）。高浓度的DHA（200μM和1000μM）可以诱导细胞生成脂质过氧化物（P<0.01）。然而,所有EPA处理组中脂质过氧化物的生成量均与对照组无显著差异。巨噬细胞的吞噬能力随EPA或DHA浓度的升高呈先上升后下降的趋势,5μM的DHA显著提高细胞的吞噬能力（P<0.05）,而高浓度的EPA或DHA（200μM和1000μM）显著抑制了其吞噬能力（P<0.01）。EPA可以显著提高大黄鱼头肾巨噬细胞O2-生成量（P<0.05）,而DHA则显著抑制了O2-生成量（P<0.05）。EPA或DHA显著抑制了大黄鱼头肾巨噬细胞sPLA2的生成量（P<0.01）,并且与EPA相比,DHA的抑制作用更明显。1000μM的EPA或DHA显著地促进了细胞PGE2的生成量（P<0.01）,其他EPA或DHA浓度均抑制巨噬细胞PGE2的生成量。EPA或DHA对IL-1β的生成量却无显著影响,且培养液中IL-1β的浓度都处于一个较低的水平（约6pg/ml左右）。本研究首次利用大黄鱼头肾巨噬细胞体外模型研究ARA、EPA或DHA对离体巨噬细胞的免疫调控作用。ARA、EPA或DHA可以显著影响离体细胞的部分生理指标和免疫指标,其表现出的免疫调控特点与高不饱和脂肪酸浓度、作用时间以及脂肪酸种类密切相关。同时也证明,鱼类细胞培养技术可以应用于脂肪酸营养免疫的研究,有助于阐明脂肪酸调控鱼类免疫力的部分机理。

论文目录

摘要

Abstract

引言

第一章文献综述

1 鱼类细胞培养技术研究进展

1.1 细胞培养的研究现状

1.2 鱼类细胞培养的应用与特点

1.3 鱼类细胞培养的分类

1.4 鱼类细胞培养的取材

1.5 鱼类细胞原代培养的取材方法

1.6 鱼类细胞原代培养方法

1.7 前景展望

2 鱼类细胞培养技术在脂肪酸营养免疫研究中的应用

2.1 前言

2.2 鱼类细胞培养技术在脂肪酸营养免疫研究应用中的可行性

2.3 影响实验结果的因素

2.3.1 脂肪酸的添加形式

2.3.2 培养基的成份

2.3.3 细胞培养温度

2.4 脂肪酸对离体鱼类细胞免疫力的影响

2.5 小结

第二章大黄鱼头肾巨噬细胞的分离、鉴定以及培养

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 大黄鱼头肾巨噬细胞的分离培养

2.2.2 细胞回收率以及细胞活力的测定

2.2.3 细胞形态学观察以及瑞氏-吉姆萨染色

2.2.4 大黄鱼头肾巨噬细胞的超微结构观察

2.2.5 细胞吞噬能力的测定

2.2.6 呼吸爆发活性的测定

2.2.7 一氧化氮（NO）生成量的测定

2.3 数据分析

3 实验结果

3.1 大黄鱼头肾的形态位置

3.2 大黄鱼头肾巨噬细胞的分离纯化

3.3 细胞贴壁率和细胞活力

3.4 细胞形态学观察以及瑞姬氏染色

3.5 透射电镜观察

3.6 扫描电镜观察

3.7 吞噬

3.8 呼吸爆发活性

3.9 NO 生成量

4 讨论

4.1 巨噬细胞的分离

4.2 巨噬细胞培养的温度

4.3 脂多糖对大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发的影响

4.4 脂多糖对大黄鱼头肾巨噬细胞NO 生成的影响

5 小结

附图和表格

第三章花生四烯酸对大黄鱼头肾巨噬细胞营养生理及免疫力的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验试剂与仪器

2.1.1 主要试剂

2.1.2 实验仪器

2.2 大黄鱼头肾巨噬细胞的培养

2.3 BSA 以及ARA-BSA 溶液的配置

2.3.1 2%牛血清白蛋白溶液（BSA 溶液）

2.3.2 花生四烯酸-胎牛血清白蛋白复合物（ARA-BSA）的配置

2.4 主要实验指标的测定

2.4.1 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞活力的影响

2.4.2 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞过氧化物生成量的影响

2.4.3 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞吞噬能力的影响

2.4.4 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性的影响

2、sPLA₂ 以及IL-1β在孵育后巨噬细胞的分泌变化'>2.4.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测PGE₂、sPLA₂以及IL-1β在孵育后巨噬细胞的分泌变化

2.5 数据分析

3 实验结果

3.1 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞活力的影响

3.2 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞脂质过氧化物生成量的影响

3.3 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞吞噬能力的影响

3.4 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性的影响

3.5 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞sPLA2 生成量的影响

3.6 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞PGE2 生成量的影响

3.7 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β生成量的影响

4 讨论

4.1 ARA 对大黄鱼巨噬细胞活力的影响

4.2 ARA 对大黄鱼巨噬细胞吞噬、呼吸爆发活力的影响

4.3 ARA 对大黄鱼巨噬细胞PGE2 生成的影响

4.4 ARA 对大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β生成的影响

5 小结

附图

第四章二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸对大黄鱼头肾巨噬细胞营养生理和免疫力的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验试剂与仪器

2.1.1 主要试剂

2.1.2 实验仪器

2.2 大黄鱼头肾巨噬细胞

2.3 BSA 以及EPA/DHA-BSA 溶液的配置

2.4 主要实验指标的测定

2.4.1 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞活力的影响

2.4.2 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞过氧化物生成量的影响

2.4.3 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞吞噬能力的影响

2.4.4 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性的影响

2、sPLA₂ 以及IL-1β的分泌变化'>2.4.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 EPA、DHA 孵育后巨噬细胞的PGE₂、sPLA₂以及IL-1β的分泌变化

2.5 数据分析

3 实验结果

3.1 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞活力的影响

3.2 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞脂质过氧化物生成量的影响

3.3 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞吞噬能力的影响

3.4 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性的影响

2 生成量的影响'>3.5 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞sPLA₂生成量的影响

2 生成量的影响'>3.6 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞PGE₂生成量的影响

3.7 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β生成量的影响

4 讨论

4.1 EPA、DHA 对大黄鱼巨噬细胞活力的影响

4.2 EPA、DHA 对大黄鱼头肾巨噬细胞吞噬和呼吸爆发的影响

2 生成的影响'>4.3 EPA、DHA 对大黄鱼巨噬细胞PGE₂生成的影响

4.4 EPA、DHA 对大黄鱼巨噬细胞IL-1β生成的影响

5 小结

附图

参考文献

致谢

高不饱和脂肪酸对离体大黄鱼头肾巨噬细胞营养生理及免疫力的影响

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