论文摘要
目的 我们的前期研究显示,苦参碱对急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞株具有逆转耐药作用,1μmol/l ATRA与苦参碱联用时,NB4-R1与NB4细胞的分化能力均随苦参碱浓度递增而增强,且两者均在苦参碱100μmol/l时达到最大值。因此,我们进一步探讨苦参碱诱导维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞分化的可能机制。方法①以全反式维甲酸敏感的APL细胞系NB4及其耐药株NB4-R1作为研究对象。光学显微镜下观察各组细胞形态。②用NBT还原实验分析各组细胞分化能力的变化。③流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达变化。④用Western blot检测各组急性早幼粒细胞白血病融合基因PML-RARa蛋白的表达。⑤免疫组化法检测各组拓扑异构酶Top0Ⅱβ亚型的表达变化。⑥ELISA法检测各组细胞内cAMP含量及细胞内蛋白激酶A（PKA）的活性。结果 ①光学显微镜下可见：予0.1mmol/1苦参碱联合1 m0l/l ATRA作用于NB4和NB4-R1,可使二种细胞株均向成熟细胞分化。②NBT还原阳性率显示：与ATRA单药组相比,0.1mmol/l苦参碱协同1 mol/l ATRA作用于NB4-R1细胞时,使其NBT还原阳性率明显增高（12% VS 41.33%）；而对NB4细胞则无明显变化（34.67±2.05% VS 39.67±2.49%）。③CD11b阳性百分率显示：与空白对照组（23.455%±5.933%）相比,单独苦参碱（27.62%±3.720%）或单独ATRA（32.776%±6.610%）作用于NB4-R1,可以部分促进细胞表面CD11b的表达,苦参碱联合ATRA可以明显增加CD11b的表达（23.455±5.933% VS 46.888±7.847%,P<0.05）。对于NB4细胞株,单独苦参碱（19.097±7.576%）只能部分增加细胞表面CD11b的表达；单药ATRA组与苦参碱+ATRA联合用药组均能使细胞表面CD11b明显升高（80.383%±5.917% VS 79.058%±4.075%）,与空白对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01,P<0.01）,但二者相比无明显差异。④采用Western blot法检测苦参碱作用前、后细胞急性早幼粒细胞白血病融合基因PML-RARa蛋白表达的改变,结果显示：空白组NB4和NB4-R1细胞PML-RARa蛋白表达水平基本相同；ATRA单药组可使NB4细胞PML-RARa蛋白表达明显下降,而对NB4-R1则无明显作用；苦参碱联合ATRA可使二者的PML-RARa蛋白表达明显下降。⑤免疫组化法检测各组拓扑异构酶Topo Ⅱ β亚型的表达,结果显示：单用苦参碱对NB4及NB4-R1细胞内Topo Ⅱ β均无明显作用；ATRA联合苦参碱能降低耐药细胞株NB4-R1细胞内TopoⅡ β含量（P<0.05）。⑥为探讨苦参碱协同ATRA诱导细胞分化的可能途径及信号传导机制,采用ELISA法检测药物作用前、后细胞内cAMP含量及细胞内蛋白激酶A（PKA）的活性,结果显示：单用苦参碱（0.1mmol/L）对NB4及NB4-R1细胞内cAMP和PKA均无明显作用；ATRA联合苦参碱能增加耐药细胞株NB4-R1细胞内cMAP含量（P<0.05）,及PKA蛋白激酶活性（P<0.01）。结论①苦参碱体外能协同全反式维甲酸使NB4-R1细胞分化成熟。②苦参碱体外诱导NB4-R1细胞分化的作用机制：促进PML-RARa蛋白的降解；降低Topo Ⅱ β的表达；提高细胞内cMAP含量及PKA蛋白激酶活性,调节cAMP-PKA信号通路。
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