水通道蛋白4在局部脑缺血再灌注损伤中的作用

论文摘要

脑卒中（stroke）作为当今世界人口的第二大致死性疾病,因其致残、复发率高,严重危害着人类健康。其中,急性缺血性卒中（acuteischemic stroke,AIS）约占脑卒中人群的80%,是由脑局部血供中断引起的神经功能损伤。大量研究发现,脑血管闭塞可致病变部位缺血缺氧,引起一系列复杂的瀑布式级联反应。尽管目前临床治疗措施很多,但多数疗效并不理想。究其原因,主要由于治疗靶点过于单一、无法切断AIS诱导的信号级联网络所致,因此无法避免病程的进一步发生、发展。以往观点认为,治疗AIS除及时恢复血供外,靶向神经元本身进行保护、阻断神经元死亡过程中的一个或几个环节,便可避免神经元继发性损伤的发生。多年来,人们一直在努力寻求能够保护缺血脑组织免受缺血损伤的药物。针对神经元保护,人们开发了种类繁多的神经保护剂,进行了数以百计的动物及临床试验,包括谷氨酸受体（glutamate receptors,GluRs）拮抗剂、自由基清除剂、抗炎性药物、离子通道调节剂、Caspases抑制剂以及增强内源性神经保护机制的多种神经生长因子或营养因子等。然而,上述药物应用于卒中患者后却无一奏效。近年来随着认识的不断深入,愈来愈多的研究发现,任何致神经元损伤的因素均可能同时波及到脑内其他细胞,尤其是胶质细胞以及血管内皮细胞,其病理改变可进一步加速神经元走向死亡。脑内胶质细胞与神经元之间形成复杂的信号交谈网络,在诸多病理生理过程中发挥特殊作用。因此作为整体功能单位,脑的神经功能恢复不能仅限于单一神经元保护,而应着眼于包括胶质细胞在内的整个“神经血管单元（neurovascular unit）”功能的维护。神经血管单元中,星形胶质细胞由于与神经元联系紧密,可将血管性信号传递至脑内,因此被认为在脑卒中的病理生理过程中发挥了决定性作用。星形胶质细胞通过释放胶质递质（gliotransmitters）,参与脑内多种信息的加工处理,不但对神经元突触信号的传递产生影响,还可通过释放血管活性分子实现血管紧张度的神经调节功能。因此,靶向于神经血管单元中的胶质细胞、尤其是星形胶质细胞功能的调控,已成为脑卒中等多种神经系统疾病治疗的重要策略。水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP4）作为脑内含量最丰富、转运效率最高的水通道蛋白（aquaporins,AQPs）亚型,主要定位于神经血管单元中的星形胶质细胞以及室管膜上皮细胞,尤其富集于星形胶质细胞朝向血管面及软脑膜面的胞膜区。此分布特点提示,AQP4在脑内内环境稳态及星形胶质细胞功能维持中发挥重要作用,可能是胶质细胞参与整个脑功能调节的重要结构基础。大量研究结果显示,AQP4基因缺失可致星形胶质细胞多种重要生理功能异常,继而影响多种病理生理过程。研究发现,AQP4蛋白下调或缺失可导致细胞发育、增殖、迁移、修复等多项功能发生障碍,空间钾缓冲能力下降,细胞骨架蛋白结构异常。此外,AQP4还参与了小胶质细胞活化、血-脑屏障（blood-brain barrier,BBB）完整性调控等过程。已有资料表明,AQP4与脑水肿、脑损伤以及脑肿瘤的发生、发展密切相关。有研究认为,脑缺血过程中AQP4的作用仅限于介导脑内跨膜水转运过程,调节脑组织水肿程度。然而AQP4是否还通过影响神经血管单元功能、尤其是星形胶质细胞功能,参与脑卒中病程的发生、发展,目前尚未见报道。本文工作应用本实验室自行制备的AQP4基因敲除鼠,首先发现AQP4参与局部脑缺血再灌注损伤,从整体、细胞及分子水平研究并阐明AQP4在脑卒中发生、发展中的重要地位,揭示AQP4可通过调制星形胶质细胞功能,尤其是谷氨酸转运体（glutamate transporters,GluTs）功能,参与脑卒中病理生理改变的作用机制。研究结果不仅为AQP4神经生物学的研究开拓新领域,深化对AQP4生理及病理功能的认识,而且揭示AQP4是星形胶质细胞功能调节的重要靶点,为脑卒中临床治疗学的突破和研发理想的神经保护剂提供有益靶标。第一部分AQP4基因缺失对tMcAO模型小鼠局部脑缺血再灌注损伤的影响目的:研究并阐明AQP4在局部脑缺血再灌注损伤中的作用,探讨氟西汀（fluoxetine,Flu）脑缺血保护与AQP4的相关性。方法:应用3月龄成年野生型(wildtype,AQP4+/+)及AQP4基因缺失(AQP4 knockout,AQP4-/-)型雄性CD1小鼠,线栓法建立短暂性大脑中动脉栓塞（transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO）模型,统计死亡率并行神经功能缺陷评分;2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC）染色观察脑梗死体积变化;免疫组织化学法观察神经元、星形胶质、小胶质细胞数量及形态学改变;干湿比重法检测脑含水量;Western blotting及免疫组织化学法测定AQP4表达。结果:AQP4基因缺失后,1)tMCAO模型小鼠死亡率增高,神经功能缺陷加重,脑梗死体积增大;缺血再灌注（ischemiareperfusion,IR）损伤程度与缺血时间长短的相关效应消失;2)IR所致的海马CA1区神经元丢失严重,星形及小胶质细胞增殖活化障碍;3)tMCAO术后24 h AQP4蛋白表达降低,72 h表达增高;4)AQP4基因缺失后小鼠基础及病理条件下脑含水量均显著增高。腹腔注射Flu 40 mg/kg,5)显著降低AQP4+/+型小鼠术后24 h死亡率、改善小鼠神经行为学障碍并减小小鼠脑梗死体积,对AQP4-/-型小鼠无上述保护作用;6)显著提高AQP4+/+型小鼠海马CA1区神经元存活率,缓解缺血核心区星形胶质细胞增殖（不影响半暗带星形胶质细胞增殖）,抑制小胶质细胞活化,对AQP4-/-型小鼠无显著影响;7)显著上调术后24 h AQP4表达,下调术后72 h AQP4表达;8)显著降低AQP4+/+型小鼠术后72 h脑含水量,对AQP4-/-型小鼠脑含水量无显著影响。结论:AQP4基因缺失导致CD1小鼠局部脑缺血再灌注损伤加重,Flu神经保护作用与调节AQP4表达相关。第二部分AQP4基因缺失对谷氨酸所致兴奋性神经毒性的影响及其机制研究一、AQP4基因缺失对神经元-星形胶质细胞共培养体系中谷氨酸兴奋性神经毒性的影响目的:研究并阐明AQP4在谷氨酸（glutamate,Glu）引起的兴奋性神经毒性中的作用,探讨其与星形胶质细胞功能调控的相关性。方法:取孕13～15d及生后3d内AQP4+/+及AQP4-/-型CD1小鼠,分别培养原代神经元及星形胶质细胞,倒扣爬片法建立神经元-星形胶质细胞共培养体系,Glu 100μM制备兴奋性神经毒性模型,免疫细胞化学法观察细胞形态改变;LDH释放量测定评价细胞损伤情况;MTT比色法检测细胞活力。结果:1)AQP4+/+、AQP4-/-型原代星形胶质细胞在形态学及细胞生长特性方面未见明显差异;2)100μM Glu可显著引起两种基因型神经元-星形胶质共培养体系中细胞总LDH释放增加,AQP4-/-型释放量显著高于AQP4+/+型;3)AQP4基因缺失后Glu所致星形胶质细胞LDH释放减少、存活率增加,提示共培养体系中增高的LDH主要由受损神经元释放。结论:星形胶质细胞AQP4基因缺失导致神经元-星形胶质细胞共培养体系Glu诱导的兴奋性神经毒性损伤加重、星形胶质细胞自身对Glu毒性的敏感度降低,表明AQP4参与Glu兴奋性神经毒性损伤过程,揭示星形胶质细胞功能改变可能是加剧共培养体系中神经元损伤的关键因素。二、AQP4基因缺失加重谷氨酸所致兴奋性神经毒性损伤机制的研究目的:研究并阐明AQP4基因缺失导致Glu兴奋性神经毒性损伤加重的具体机制,探讨其与星形胶质细胞GluTs功能调控的相关性。方法:取生后3d内AQP4+/+及AQP4-/-型CD1乳鼠,原代培养星形胶质细胞,RT-PCR及Western blotting测定细胞GluTs mRNA及蛋白表达;[3H]-D,L-Glu同位素标记法检测细胞Glu摄取功能。结果:AQP4基因缺失后,1)星形胶质细胞谷氨酸转运体1（glutamate transporter 1,GLT-1）mRNA及蛋白水平下调,谷氨酸/天冬氨酸转运体（glutamate/aspartate transporter,GLAST）水平无显著改变;2)星形胶质细胞摄取[3H]-D,L-Glu能力降低。结论:AQP4基因缺失下调星形胶质细胞GLT-1表达,降低细胞Glu摄取能力,表明AQP4参与星形胶质细胞功能调控,其缺失导致Glu兴奋性神经毒性损伤加重的机制可能与GluTs功能降低有关。综上所述,本研究工作的主要创新之处在于:1.应用AQP4基因缺失小鼠,从整体、细胞和分子水平系统研究并阐明AQP4与脑卒中的发生、发展相关,明确其机制在于对星形胶质细胞功能的调节。研究结果丰富并拓展了AQP4在脑卒中神经损伤中的作用机制,为疾病的临床治疗提供了新的思路。2.揭示Flu的脑缺血保护作用与调节AQP4表达相关,为将AQP4调节剂发展成为脑卒中治疗的新型药物积累了必要的学术与实验基础。3.首次发现AQP4参与调控Glu兴奋性神经毒性过程,阐明其机制在于调节星形胶质细胞GluTs表达及Glu摄取功能,揭示AQP4是星形胶质细胞功能调节的重要靶点,为研发理想的神经保护药物——胶质细胞功能调节剂提供了新的靶标,也为靶向于星形胶质细胞功能调控药物应用于脑卒中等神经系统疾病的临床治疗提供了理论依据。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、脑卒中的基础与临床研究
• 二、水通道蛋白4
• 三、本文工作的主要研究内容与意义
• 第一部分 AQP4基因缺失对tMCAO模型小鼠局部脑缺血再灌注损伤的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 AQP4基因缺失对谷氨酸引起的兴奋性神经毒性的影响及其机制研究
• 一、AQP4基因缺失对神经元-星形胶质细胞共培养体系中谷氨酸兴奋性神经毒性的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 二、AQP4基因缺失加重谷氨酸所致兴奋性神经毒性损伤机制的研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的研究论文
• 综述
• 致谢