枯草芽孢杆菌rib操纵子表达元件的修饰

论文摘要

重组枯草芽孢杆菌生产核黄素是目前最先进的核黄素工业生产技术。构建高产核黄素的重组菌,关键问题之一是提高核黄素操纵子的表达水平。利用游离或整合的表达质粒过量表达核黄素操纵子,需要利用抗生素的选择压力维持游离质粒的稳定,或者维持整合质粒在染色体上的多拷贝状态。在重组枯草芽孢杆菌中,重组质粒不稳定问题是限制重组枯草芽孢杆菌工业应用的主要因素。实现单拷贝基因在染色体上的高水平表达,构建无抗性基因标记的重组菌株,是解决重组质粒不稳定,避免抗性基因和抗生素危害的有效手段。本文利用B. subtilis gInR基因天然的组成型强表达启动子和含有SD序列的mRNA前导区编码序列,对B. subtilis核黄素操纵子的启动子区域进行原位替换修饰,目的是去除原有的riboswicth调控元件,更换强启动子,在mRNA的5′末端引入另一个SD序列,以实现核黄素操纵子的高水平表达。通过重叠PCR拼接了一段带有氯霉素抗性基因和核黄素操纵子上下游序列的A-CAT-R片段,转化过量合成核黄素的B. subtilis 24X1,通过双交换重组,用氯霉素抗性基因将核黄素操纵子的启动子区域交换下来,得到了抗氯霉素的核黄素缺陷型B. subtilis 24 CS1。通过重叠PCR拼接了一段包括gInR基因启动子区域和核黄素操纵子上下游序列的A-prm-R片段,转化B. subtilis 24 CS1,通过同源重组将氯霉素抗性基因交换下来,同时修饰了核黄素操纵子的启动子区域,得到了转化子B. subtilis 24 CS2。菌落呈现的黄色表明,修饰后的启动子区域能够使核黄素操纵子正确表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 B. subtilis rib 操纵子与核黄素合成途径
• 1.1.1 rib 操纵子的结构
• 1.1.2 rib 操纵子的功能
• 1.1.3 核黄素生物合成途径
• 1.2 rib 操纵子的表达调控机制
• 1.2.1 riboswitch 调控机制
• 1.2.2 FMN 与rib 操纵子的转录终止调控
• 1.2.3 ribC 和ribR 基因
• 1.3 B. subtilis 的基因表达元件
• 1.3.1 启动子
• 1.3.2 SD 序列
• 1.3.3 起始密码子
• 1.3.4 终止子
• 1.3.5 mRNA 的稳定性
• 1.4 产核黄素枯草芽孢杆菌工程菌的构建
• 1.5 rib 操纵子的过量表达的技术手段
• 1.6 本文的研究内容和目的
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 B. subtilis 出发菌株的筛选
• 2.2.2 B. subtilis 染色体DNA 提取
• 2.2.3 质粒的小规模提取
• 2.2.4 PCR 扩增
• 2.2.5 重叠PCR
• 2.2.6 酚抽提和乙醇沉淀
• 2.2.7 DNA 片段的回收纯化
• 2.2.8 DNA 的酶切
• 2.2.9 DNA 连接反应
• 2.2.10 B.subtilis 24 原生质体的制备与转化
• 2.2.11 菌种的保藏
• 2.3 PCR 和重叠PCR 扩增的引物
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 rib 操纵子表达元件的分析和修饰方案的确定
• 3.1.1 ribP1 启动子分析
• 3.1.2 ribP1 区域的mRNA 前导序列的特征分析
• 3.1.3 ribP1 区域转录的mRNA 的特征分析
• 3.1.4 ribP2 启动子分析
• 3.1.5 ribP2 的mRNA 前导序列的特征分析
• 3.1.6 ribP1 区域转录的mRNA 的特征分析
• 3.1.7 rib 操纵子的终止子
• 3.1.8 修饰方案确定
• 3.2 构建含氯霉素抗性基因的同源重组片段A-cat-R
• 3.2.1 氯霉素抗性基因cat 片段的定位
• 3.2.2 A 片段的扩增
• 3.2.3 cat 片段的扩增
• 3.2.4 R 片段的扩增
• 3.2.5 r 片段的扩增
• 3.2.6 A-cat-R 的PCR 扩增
• 3.2.7 A-cat-R 与r 的连接
• 3.3 核黄素缺陷菌B. subtilis 24 C51 的筛选
• 3.3.1 同源重组片段A-cat-R-r 转化
• 3.3.2 转化子的验证
• 3.4 同源重组片段A’-prm-R’的构建
• 3.4.1 rib 操纵子启动区上下游片段A’，R’的扩增
• 3.4.2 gInR 表达元件prm 片段的扩增
• 3.4.3 A’-prm-R’的PCR 扩增
• 3.5 核黄素操纵子表达元件的修饰
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢