百合上李属坏死环斑病毒和百合无症病毒的研究

论文摘要

百合（Lilium L.）是集观赏、食用、药用于一身的重要经济作物,现已成为国际上重要切花观赏花卉之一。近年来,随着我国观赏百合种植面积的迅速增加,从国外引进种球的数量和批次迅速增长,百合病毒病开始在各百合种植区发生流行。本文以发生在百合上的两种重要的病毒,百合无症病毒（Lily symptomless virus,LSV）和李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）为研究对象,利用分子生物学技术,对上述两种检疫性病毒基因组的分子特征进行了比较研究,分析不同地区LSV的来源、分布及相关性,建立了多重PCR、RNA点杂交和RNA玻片杂交等适用于进境口岸百合种球病毒检疫工作的快速检测方法。研究获得的主要结果和结论如下:1、揭示了PNRSV外壳蛋白基因序列与其病害症状类型间的相关性,并利用该分子特征建立起的多重RT-PCR检测方法,用于PNRSV轻型和重型两种不同的株系的初诊和快速检测。根据GenBank中已报道的PNRSV外壳蛋白的基因序列,分析不同致病型株系间核酸水平上的差异,设计了两对特异性引物,并通过扩增条件的优化,建立了可区分PNRSV轻型和重型株系的多重PCR检测方法。该方法对已知的待测样品进行检测,在同一反应体系中扩增出了450bp和170bp两种大小的条带,可区分PNRSV轻型和重型两种不同的株系。揭示了PNRSV外壳蛋白基因序列与其病害症状类型间的具有相关性并可用于不同致病型株系的快速诊断和检测。2、在分子水平上鉴定了百合上发生的PNRSV,证实PNRSV可通过百合种球带毒传播。对待测荷兰进口的百合种球进行随机抽样,在温室内种植并观察,长出叶片后,用RNA Extraction Kit （Sangon, China）从幼嫩的叶组织中提取核酸。用根据PNRSV外壳蛋白基因序列设计的特异性引物进行RT-PCR扩增,电泳PCR产物。从待测的两个样品（P-299和P-503）中获得了450bp的目标片段。低熔点胶回收PCR产物,经纯化后克隆至pGEM-TG1载体,测序后进行序列比对分析。将所获得的上述两个分离物的核酸序列与GenBank中已报道的27个PNRSV分离物的CP基因序列进行比对,结果表明,P-299与P-503 CP基因序列相似性为99.8%。P-299和P-503 CP基因序列与27个已报道的分离物CP基因序列的相似性为84.5%～99.1%。据此可知扩增片段为PNRSV的部分CP基因序列,在分子水平上鉴定了百合上发生的PNRSV。将上述两个分离株的CP基因序列登陆GenBank进行了注册,P-299的登陆号为DQ992416;P-503的登陆号为DQ992417。用插入了P-299分离株的部份CP基因互补序列的质粒P-299B做模板进行PCR,回收PCR产物,制备32P标记探针,对来自浙江丽水县田间的野生百合样品进行RNA斑点杂交检测,在24个百合样品中有5个杂交结果为阳性,证实了PNRSV在自然条件下可通过百合种球带毒传播,说明了百合是PNRSV的一个新寄主。3、本研究采用RT-PCR法从来自国内不同地区进口百合次生代样品上获得了7个含有LSV基因组3′端部分序列的分离株。经过测序,应用DNAStar软件比较了其与已报道的12个LSV分离株的CP基因和16kD基因的同源性。序列分析结果表明:7个分离株蛋白外壳部分基因序列和16kD蛋白基因序列的相似性分别为87.4%100%和97.9%100%;在氨基酸水平上的相似性分别为95.9%100%和95.7%100%。系统发育树的比较显示,本研究获得的7个LSV分离株间在系统中有较近的进化关系,但这些分离株间没有明显的地域相关性,也没有发现与块根频繁运输相关的新亚群。4、建立了RNA玻片杂交检测LSV的新方法。使用该方法对国内不同地区的进口和野生百合上LSV的发生情况进行了检测,结果表明LSV是存在中国境内百合上最为普通的病毒之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 百合的生产情况
• 1.1.1 生产与种植情况
• 1.1.2 制约百合生产的主要矛盾
• 1.2 两种重要的检疫性病毒
• 1.2.1 百合无症病毒（LSV）引起的病害及病毒生物学特性
• 1.2.2 李属坏死环班病毒（PNRSV）引起的病害及病毒生物学特性
• 1.3 植物病毒诊断技术方法
• 1.3.1 生物学方法
• 1.3.2 电子显微镜观察法
• 1.3.3 血清学方法
• 1.3.4 分子生物学方法
• 1.3.5 蛋白与核酸特征结合的鉴定方法
• 1.3.6 几种常用方法检测植物病毒灵敏度比较分析
• 1.4 百合无症病毒的分子特征及检测技术研究进展
• 1.4.1 LSV 病毒分子特征研究
• 1.4.2 LSV 病毒的检测技术研究
• 1.5 李属坏死环斑病毒的分子特征及检测技术研究进展
• 1.5.1 PNRSV 病毒分子特征研究
• 1.5.2 PNRSV 病毒的检测技术研究
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 PNRSV 的CP 基因特征与多重PCR 检测技术构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 病毒材料的准备
• 2.2.2 制备TES DIECA 抽提缓冲液
• 2.2.3 总RNA 的提取
• 2.2.4 RT-PCR 体系的建立
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 PNRSV 与等轴不稳环斑病毒属成员的RNA 3 结构特征比较
• 2.3.2 PNRSV 不同株系间在RNA3 上CP 基因的结构变异研究
• 2.3.3 基于PNRSV 中RNA3 特征的特异性引物设计
• 2.3.4 PNRSV 不同致病类型的分子鉴定
• 2.3.5 讨论
• 第三章 李属坏死环斑病毒百合分离物的鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 病毒材料的采集与保存
• 3.2.2 方法
• 3.2.3 引物的设计与合成
• 3.2.4 RT-PCR 扩增体系的建立
• 3.2.5 RT-PCR 产物克隆、鉴定和测序分析
• 3.2.6 RNA 斑点杂交
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PNRSV 百合阳性样品的检出
• 3.3.2 PNRSVCP 基因片段的克隆
• 3.3.3 PNRSV 的CP 基因核苷酸序列特征分析
• 3.3.4 利用斑点杂交技术检测百合中的PNRSV
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第四章 百合无症病毒的分子特征与分子检测技术研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 病毒来源和试剂
• 4.2.2 引物
• 4.2.3 反转录与PCR 扩增
• 4.2.4 核酸序列及同源性比较
• 4.2.5 RNA 玻片杂交检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 序列分析
• 4.3.2 LSV RNA 点杂交检测
• 4.4 讨论
• 第五章 全文结论
• 5.1 结论
• 5.2 本研究的创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历