论文摘要
目的:以糖尿病胃轻瘫大鼠为模型,研究糖尿病不同时期ICC表型的变化,探讨糖尿病大鼠ICC减少的深层原因。方法:链脲佐菌素60mg/kg腹腔注射制作糖尿病大鼠模型（n=36）,分别于造模后第2周、4周、6周、8周、10周、12周处死,每期各6只,对照组（n=18）给予等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液注射,分别与同期糖尿病大鼠一起处死,每期各3只。电镜下观察其胃ICC超微结构的变化; TUNEL法检测细胞凋亡;免疫荧光双重染色观察肌间层是否存在ICC与平滑肌肌丝蛋白α-SMA（平滑肌α-actin）、desmin（平滑肌结蛋白）或SMHC（平滑肌肌球蛋白重链）的双重表达;RT-PCR和Western Blot法检测c-kit、α-SMA、desmin、SMHC和SMLC（平滑肌肌球蛋白轻链） mRNA和蛋白表达的变化。结果:（1）自第4周起糖尿病组大鼠胃肌间层可见c-kit和desmin、c-kit和SMHC的双重标记的ICC细胞,但未见c-kit和α-SMA的双重标记的ICC细胞;对照组未见双重标记的ICC细胞。（2）糖尿病第4周起电镜下可见兼具ICC和平滑肌超微结构特征的“中间状态”的ICC细胞,富含微丝和中间丝,并成束状与细胞外缘并行,外观类似平滑肌细胞,细胞质密度高于邻近的平滑肌细胞。（3）两组大鼠胃肌间层均未见凋亡细胞。（4）糖尿病组大鼠胃c-kit的mRNA表达（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.60±0.15 vs 0.39±0.15 vs 0.39±0.11, P<0.05）随糖尿病病程延长而下降;平滑肌肌丝蛋白α-SMA的mRNA表达（2wk vs 6wk vs 12wk: 1.19±0.08 vs 1.21±0.11 vs 1.19±0.13, P>0.05）无显著变化;平滑肌肌丝蛋白desmin （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.58±0.11 vs 0.67±0.13 vs 0.78±0.14, P<0.05）、SMHC （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.34±0.08 vs 0.46±0.08 vs 0.63±0.11, P<0.05）和SMLC （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.24±0.07 vs 0.29±0.08 vs 0.31±0.06,P<0.05）的mRNA表达均上升。对照组大鼠各期c-kit （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.61±0.15 vs 0.61±0.12 vs 0.58±0.15, P>0.05）、平滑肌肌丝蛋白α-SMA （2wk vs 6wk vs 12wk:1.25±0.09 vs 1.22±0.14 vs 1.22±0.13, P>0.05）、desmin （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.58±0.11 vs 0.57±0.12 vs 0.51±0.13, P>0.05）、SMHC （2wk vs 6wk vs 12wk:0.31±0.06 vs 0.29±0.10 vs 0.31±0.06, P>0.05）和SMLC （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.23±0.06 vs 0.25±0.06 vs 0.21±0.08,P>0.05）的mRNA表达均无显著变化。（5）糖尿病组大鼠胃c-kit的蛋白表达（2wk vs 6wk vs 12wk:0.37±0.09 vs 0.24±0.08 vs 0.11±0.04,P <0.05）随糖尿病病程延长而下降;平滑肌肌丝蛋白α-SMA的蛋白表达（2wk vs 6wk vs 12wk: 1.49±0.19 vs 1.43±0.24 vs 1.51±0.20, P>0.05）无显著变化;平滑肌肌丝蛋白desmin （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.72±0.10 vs 0.76±0.14 vs 0.84±0.15, P <0.05）、SMHC （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.53±0.14 vs 0.62±0.14 vs 0.65±0.16,P <0.05）和SMLC （2wk vs 6wk vs 12wk:0.11±0.02 vs 0.18±0.06 vs 0.29±0.06,P <0.05）的蛋白表达均上升。对照组大鼠各期c-kit蛋白（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.44±0.10 vs 0.42±0.10 vs 0.37±0.0, P>0.05）、平滑肌肌丝蛋白α-SMA （2wk vs 6wk vs 12wk: 1.50±0.22 vs 1.49±0.23 vs 1.52±0.22,P>0.05）、desmin （2wk vs 6wk vs 12wk:0.69±0.13 vs 0.67±0.14 vs 0.67±0.14, P>0.05）、SMHC（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.69±0.15 vs 0.69±0.08 vs 0.64±0.10, P>0.05）和SMLC （2wk vs 6wk vs 12wk: 0.10±0.03 vs 0.09±0.03 vs 0.09±0.03, P>0.05）的蛋白表达均无显著变化。结论:糖尿病大鼠胃内ICC表型可能在糖尿病病程中早期起向平滑肌表型转化。目的:以糖尿病胃轻瘫大鼠为模型,研究糖尿病不同时期SCF/KIT信号通路在ICC表型转化中的作用。方法:链脲佐菌素60mg/kg腹腔注射制作糖尿病大鼠模型（n=36）,分别于造模后第2周、4周、6周、8周、10周、12周处死,每期各6只,对照组（n=18）给予柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液注射,分别与同期糖尿病大鼠一起处死,每期各3只。ELISA方法检测血清中游离型SCF （S-SCF）的浓度变化;RT-PCR和Western Blot法检测膜结合型SCF（M-SCF）表达的变化。结果:（1）对照组大鼠各期S-SCF含量（2wk vs 6wk vs 12wk:1303.76±194.80 vs 1267.02±128.52 vs 1212.87±123.47 pg/ml, P>0.05）无显著变化。自第2 wk起,糖尿病组S-SCF含量较对照组显著下降（2wk糖尿病组vs对照组: 278.63±37.28 vs 1303.76±194.80 pg/ml,6wk糖尿病组vs对照组:263.92±30.74 vs 1267.02±128.52 pg/ml,12wk糖尿病组vs对照组:228.05±41.56 vs 1212.87±123.47 pg/ml,P<0.001）,且随糖尿病病程延长而显著下降（2wk vs 6wk vs 12wk:278.63±37.28 vs 263.92±30.74 vs 228.05±41.56 pg/ml, P<0.01）。S-SCF的含量与c-kit mRNA表达呈正相关（r=0.861, P=0.028）;S-SCF的含量与c-kit蛋白表达呈正相关（r=0.927, P=0.008）。（2）对照组大鼠各期M-SCF mRNA表达（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.82±0.12 vs 0.83±0.15 vs 0.82±0.13, P>0.05）无显著变化;糖尿病组大鼠各期M-SCF mRNA表达较对照组显著下降,且随糖尿病病程延长而显著下降（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.74±0.11 vs 0.63±0.12 vs 0.34±0.09,P<0.01）。M-SCF mRNA表达与c-kit mRNA表达呈正相关（r=0.886, P=0.019）。（3）对照组大鼠各期M-SCF蛋白表达（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.74±0.15 vs 0.69±0.13 vs 0.66±0.14, P>0.05）无显著变化;糖尿病组大鼠各期M-SCF蛋白表达较对照组显著下降,且随糖尿病病程延长而显著下降（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.43±0.08 vs 0.31±0.06 vs 0.16±0.05, P<0.05）。M-SCF蛋白表达与c-kit蛋白表达呈正相关（r=0.950, P=0.004）。结论:糖尿病胃肠动力障碍大鼠血清中游离型SCF含量和膜结合型SCF表达均随病程延长而减少,且与c-kit表达呈正相关,对维持ICC表型极为重要。目的:以糖尿病胃轻瘫大鼠为模型,研究糖尿病不同时期ICC-ENS突触连接的变化。方法:链脲佐菌素60mg/kg腹腔注射制作糖尿病大鼠模型（n=36）,分别于造模后第2周、4周、6周、8周、10周、12周处死,每期各6只,对照组（n=18）给予等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液注射,分别与同期糖尿病大鼠一起处死,每期各3只。电镜下观察其胃ICC-ENS突触连接的变化;免疫组化法观察肌间层突触素表达的变化;RT-PCR和Western Blot法检测突触素mRNA和蛋白表达的变化。结果:（1）电镜发现,随着糖尿病病程延长,大鼠胃内肌间层的神经结构松散,部分神经出现纤维包裹,神经内出现线粒体空泡,突触囊泡明显减少。（2）免疫组化结果显示,随着糖尿病病程延长,大鼠胃内肌间层的突触素表达明显减少。（3）对照组大鼠各期突触素mRNA表达无显著变化;糖尿病组大鼠自第4 wk起,突触素mRNA表达较对照组显著下降（4wk糖尿病组vs对照组: 0.46±0.11 vs 0.64±0.17,8wk糖尿病组vs对照组:0.32±0.08 vs 0.61±0.15,12wk糖尿病组vs对照组:0.21±0.05 vs 0.60±0.16,P<0.01）,且随糖尿病病程延长而显著下降（2wk vs 6wk vs 12wk:0.52±0.13vs 0.39±0.10 vs 0.21±0.05,P<0.01）。（4）对照组大鼠各期突触素蛋白表达无显著变化;糖尿病组自第6 wk起,突触素蛋白表达较对照组显著下降（6wk糖尿病组vs对照组:0.29±0.09 vs 0.49±0.13,10wk糖尿病组vs对照组:0.17±0.04 vs 0.49±0.09,12wk糖尿病组vs对照组: 0.15±0.03 vs 0.47±0.07,P<0.05）,且随糖尿病病程延长而显著下降（2wk vs 6wk vs 12wk: 0.41±0.13 vs 0.29±0.09 vs 0.14±0.03,P<0.05）。结论:糖尿病大鼠胃内肌间层神经变性,突触囊泡明显减少,突触素免疫活性降低,突触素mRNA和蛋白表达随糖尿病病程延长而显著下降。目的:观察长脉冲胃电刺激是否能够促使糖尿病胃轻瘫大鼠ICC表型逆转。方法:埋置胃浆膜电极后制作糖尿病大鼠模型（n=32）,分别给于慢性刺激（自糖尿病病程起连续刺激4周或刺激6周,每组各8只）和急性刺激（在糖尿病病程第4周或第6周仅刺激1周,每组各8只）。免疫荧光双重染色观察肌间层c-kit与desmin（平滑肌结蛋白）或SMHC（平滑肌肌球蛋白重链）的双重表达的ICC细胞的变化;电镜下观察其胃ICC超微结构的变化; RT-PCR和Western Blot法检测c-kit、α-SMA、desmin、SMHC和SMLC mRNA和蛋白表达的变化。结果:（1）慢性胃电刺激4wk后,较同期糖尿病组更易见到c-kit和desmin、c-kit和SMHC双重阳性免疫荧光染色的ICC细胞,第4wk和第6wk的急性胃电刺激和慢性胃电刺激6周较同期糖尿病组无明显变化。（2）慢性胃电刺激4wk后,透视电镜下较同期糖尿病组更易见到兼具ICC和平滑肌超微结构特征的、细胞质密度较高的“中间状态”的ICC细胞,胞浆内含部分肌丝样结构。（3）第4wk开始的急性刺激（0.48±0.15 vs 0.50±0.13, P >0.05）、第6wk开始的急性刺激（0.39±0.15 vs 0.44±0.12, P >0.05）和慢性刺激6wk （0.39±0.15 vs 0.45±0.14, P >0.05）对c-kit mRNA表达均无显著影响;第4wk开始的慢性刺激（0.48±0.15 vs 0.58±0.14, P<0.05）可增高c-kit mRNA的表达。第4wk开始的急性刺激、第6wk开始的急性刺激和慢性刺激6wk对平滑肌肌丝蛋白α-SMA、desmin、SMHC和SMLC mRNA表达均无显著影响;第4wk开始的慢性刺激使desmin（0.61±0.10 vs 0.49±0.10,P<0.05）、SMHC（0.44±0.10 vs 0.34±0.08,P<0.05）和SMLC（0.28±0.08 vs 0.19±0.06,P<0.05）mRNA的表达降低,对但平滑肌肌丝蛋白α-SMA的mRNA表达（1.21±0.14 vs 1.22±0.12,P>0.05）无显著影响。（4）第4wk开始的急性刺激（0.34±0.09 vs 0.35±0.08,P >0.05）、第6wk开始的急性刺激（0.24±0.08 vs 0.25±0.05,P>0.05）和慢性刺激6wk （0.24±0.08 vs 0.30±0.08,P>0.05）对c-kit蛋白表达均无显著影响;第4wk开始的慢性刺激（0.34±0.09 vs 0.43±0.09,P<0.05）可增高c-kit蛋白的表达。第4wk开始的急性刺激、第6wk开始的急性刺激和慢性刺激6wk对平滑肌肌丝蛋白α-SMA、desmin、SMHC和SMLC的表达均无显著影响;第4wk开始的慢性刺激使desmin（0.75±0.13 vs 0.51±0.10, P<0.05）、SMHC（0.58±0.13 vs 0.41±0.14,P<0.05）的表达降低,但对平滑肌肌丝蛋白α-SMA（1.48±0.18 vs 1.48±0.19,P >0.05）和SMLC（0.14±0.04 vs 0.13±0.04, P >0.05）蛋白表达无显著影响。结论:慢性胃电刺激4周可能促使糖尿病大鼠胃内部分ICC表型逆转。目的:研究长脉冲胃电刺激对糖尿病大鼠胃ICC-ENS突触连接可塑性的影响。方法:制作胃电刺激糖尿病大鼠模型（n=32）,从糖尿病病程第4周和第6周第一天起分别给予急性刺激1周,或者从糖尿病病程第1天起分别给予慢性刺激4周或6周,每组各8只。透视电镜观察胃电刺激后胃肌间层ICC-ENS突触连接超微结构的变化;免疫组化法检测胃电刺激后胃肌间层突触素表达阳性细胞数目的变化;RT-PCR和Western Blot法检测突触素表达的变化。结果:（1）电镜发现4组胃电刺激后胃肌间层ICC-ENS突触囊泡都增多,囊泡内的神经递质增多。（2）免疫组化发现胃电刺激后胃肌间层突触素表达阳性细胞数目增加。（3）第4wk开始的急性刺激（0.46±0.11 vs 0.57±0.09,P<0.05）和慢性刺激4wk （0.46±0.11 vs 0.66±0.09, P<0.01）均能使突触素mRNA表达增高;慢性刺激较急性刺激（0.66±0.09 vs 0.57±0.09,P >0.05）的效应略强,但差异并不显著;第6wk开始的急性刺激（0.39±0.10 vs 0.49±0.12, P<0.05）和慢性刺激6wk （0.39±0.10 vs 0.58±0.11,P<0.05）都能显著增高突触素mRNA表达;慢性刺激较急性刺激（0.58±0.11 vs 0.49±0.12, P >0.05）的效应略强,但差异并不显著;急性刺激从第4wk开始比从第6wk开始（0.57±0.09 vs 0.49±0.12, P >0.05）增高突触素mRNA表达的效应略强,但差异并不显著;慢性刺激4wk比刺激6wk （0.66±0.09 vs 0.58±0.11, P >0.05）增高突触素mRNA表达的效应略强,但差异也不显著。（4）第4wk开始的急性刺激（0.35±0.13 vs 0.50±0.11,P<0.05）和慢性刺激4wk（0.35±0.13 vs 0.64±0.10,P<0.01）均能增强突触素蛋白表达,且慢性刺激较急性刺激效应（0.64±0.10 vs 0.50±0.11,P<0.05）更加显著;第6wk开始的急性刺激（0.29±0.09 vs 0.37±0.09, P<0.05）和慢性刺激6wk（ 0.29±0.09 vs 0.51±0.10,P<0.01）都能显著增强突触素蛋白表达,慢性刺激较急性刺激的效应（0.51±0.10 vs 0.37±0.09,P<0.05）更加显著;急性刺激从第4wk开始比从第6wk开始（0.50±0.11 vs 0.37±0.09,P<0.05）对突触素蛋白表达的影响更为显著;慢性刺激4wk比刺激6wk（0.64±0.10 vs 0.51±0.10,P<0.05）对突触素蛋白表达的影响更为显著。结论:长脉冲胃电刺激能增加糖尿病大鼠胃ICC-ENS突触重塑,早期开始的、慢性的胃电刺激效果更佳。目的:研究长脉冲胃电刺激对SCF的影响,探讨SCF/KIT信号通路在ICC表型逆转中的作用。方法:制作胃电刺激糖尿病大鼠模型（n=32）,从糖尿病病程第4周和第6周第一天起分别给予急性刺激1周,或者从糖尿病病程第1天起分别给予慢性刺激4周或6周,每组各8只。ELISA方法检测血清中游离型SCF （S-SCF）的浓度变化;RT-PCR和Western Blot法检测膜结合型SCF（M-SCF）表达的变化。结果:（1）急性和慢性刺激对S-SCF浓度无显著影响。（2）第4wk开始的急性刺激（0.65±0.14. vs 0.76±0.09,P<0.05）和慢性刺激4wk （0.65±0.14. vs 0.80±0.12,P<0.05）均能使M-SCF mRNA表达增高,但两种刺激效应之间（0.76±0.09 vs 0.80±0.12,P>0.05）无显著差异;第6wk开始的急性刺激（0.63±0.12 vs 0.66±0.07,P>0.05）虽不能显著增强M-SCF mRNA表达,但有增强表达的趋势;慢性刺激6wk（0.63±0.12 vs 0.70±0.11,P<0.05）能显著增高M-SCF mRNA表达;急性刺激从第4wk开始比从第6wk开始对M-SCF mRNA表达（0.76±0.09 vs 0.66±0.07, P<0.05）的影响更加显著;慢性刺激4wk比刺激6wk对M-SCF mRNA表达（0.80±0.12 vs 0.70±0.11,P<0.05）的效应更加显著。（3）第4wk开始的急性刺激（0.34±0.09 vs 0.56±0.12,P<0.05）和慢性刺激4wk（0.34±0.09 vs 0.64±0.09,P<0.01）均能增强M-SCF蛋白表达,且慢性刺激较急性刺激效应（0.64±0.09 vs 0.56±0.12,P<0.05）更加显著;第6wk开始的急性刺激（0.31±0.06 vs 0.33±0.10,P>0.05）尚不能显著增加M-SCF蛋白表达;但慢性刺激6wk （0.31±0.06 vs 0.47±0.10,P<0.05）能显著增强M-SCF蛋白表达,慢性刺激较急性刺激的效应（0.47±0.10 vs 0.33±0.10,P<0.05）更加显著;急性刺激从第4wk开始比从第6wk开始（0.56±0.12 vs 0.33±0.10,P<0.01）对M-SCF蛋白表达的影响更为显著;慢性刺激4wk比刺激6wk （0.64±0.09 vs 0.47±0.10,P<0.05）对M-SCF蛋白表达的影响更为显著。结论:长脉冲胃电刺激可能通过增高糖尿病大鼠膜结合型SCF表达来影响ICC表型,早期开始的、慢性的胃电刺激效果更佳。
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