鱼类IL-15及其受体α链基因家族的分子克隆、进化和功能研究

论文摘要

本文第一章绪论分三部分,分别介绍了IL-15基因克隆与结构、表达调控机制、信号转导途径、IL-15Rα基因克隆、表达调控、选择剪接、运输机制以及免疫生物学功能等。第二章至第五章为实验研究,第二章主要研究了河豚白介素15（IL-15）基因克隆、组织分布及表达规律、原核表达,并利用比较基因组学方法,分析了脊椎动物IL-15分子的进化规律。第三章研究了河豚IL-2基因的分子克隆,及另一个首次发现的鱼类特异的IL-2样的细胞因子（IL-2L）,鉴定了两者的组织分布和表达规律,并分析了IL-2,IL-2L和IL-21的进化关系及分子进化规律。第四章研究了河豚IL-15的特异性受体（IL-15Rα）的基因克隆,原核表达,抗体制备与组织分布。发现河豚IL-15Rα存在两种形式的基因,分别含有一个或两个细胞因子结合结构（sushi domain）,并命名为ssIL-15Rα（single sushi IL-15Rα,单sushi结构的IL-15Rα）和dsIL-15Rα（double sushi IL-15Rα,双sushi结构的IL-15Rα）,并证实后者由鱼类特异的全基因组复制和外显子洗牌事件产生,并发现两种受体都能不同程度的结合IL-15或IL-2。之后,我们又克隆并鉴定了虹鳟鱼的IL-15Rα基因,证实鱼类特异的全基因组复制确实影响了硬骨鱼IL-15Rα基因。第五章中,我们重点用比较基因组学和生物信息学计算方法,重建了各种脊椎动物IL-15Rα和IL-2Rα基因序列的亲缘关系。分析了基因复制和外显子洗牌对于新基因产生的重要意义,及相关分子的相对进化速率和协同进化趋势。综合以上结果,提出了IL-15Rα和IL-2Rα基因的进化模型。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目次
• 1 绪论
• 1.1 白介素15
• 1.1.1 IL-15基因
• 1.1.2 IL-15表达调控机制
• 1.1.3 IL-15的受体及信号传导
• 1.2 白介素15受体α链
• 1.2.1 IL-15Rα基因
• 1.2.2 IL-15Rα表达与选择剪接
• 1.2.3 IL-15Rα与IL-15共分泌
• 1.2.4 可溶性IL-15Rα受体
• 1.2.5 IL-15Rα参与的信号转导
• 1.2.6 反式递呈（Trans-presentation）
• 1.3 IL-15的免疫学功能
• 1.3.1 NK细胞
• 1.3.2 TCRα β T细胞
• 1.3.3 NK-T细胞
• 1.3.4 TCRγ δ肠道内上皮淋巴细胞
• 1.3.5 单核细胞/巨噬细胞
• 1.3.6 树突细胞
• 1.3.7 中性粒细胞和嗜酸性粒细胞
• 1.3.8 B细胞
• 1.4 IL-15与免疫疾病
• 1.4.1 类风湿性关节炎
• 1.4.2 肉状瘤病
• 1.4.3 炎症性肠炎与乳糜泄
• 1.5 IL-15和IL-15Rα在其他动物中的研究
• 2 鱼类IL-15分子的研究
• 2.1 鱼类IL-15的分子克隆与鉴定
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.1.1 实验鱼
• 2.1.1.2 菌株
• 2.1.1.3 试剂
• 2.1.1.4 数据库及软件
• 2.1.1.5 比较基因组学预测及分析
• 2.1.1.6 总RNA提取、检测和保存
• 2.1.1.7 第一链cDNA合成
• 2.1.1.8 3'RACE-PCR
• 2.1.1.9 5'RACE-PCR
• 2.1.1.10 PCR产物纯化
• 2.1.1.11 T-A克隆
• 2.1.1.12 测序鉴定和拼接
• 2.1.1.13 生物信息学分析软件
• 2.1.2 结果与讨论
• 2.1.2.1 IL-15全长cDNA
• 2.1.2.2 基因结构
• 2.1.2.3 氨基酸序列
• 2.2 IL-15原核表达与纯化
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 pET32b-IL-15表达质粒与菌株构建
• 2.2.1.2 原核表达
• 2.2.1.3 可溶性分析
• 2.2.1.4 SDS-PAGE
• 2.2.1.5 可溶性蛋白纯化
• 2.2.1.6 透析
• 2.2.1.7 蛋白质浓度测定
• 2.2.2 结果与讨论
• 2.2.2.1 优化诱导表达条件
• 2.2.2.2 重组IL-15蛋白纯化
• 2.3 IL-15组织表达规律研究
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.1.1 药物处理
• 2.3.1.2 RT-PCR
• 2.3.2 结果与讨论
• 2.4 IL-15进化分析
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.1.1 数据收集
• 2.4.1.2 比较基因组学分析
• 2.4.1.3 多序列比对
• 2.4.1.4 进化树构建
• 2.4.1.5 进化树与物种树调和
• 2.4.2 结果与讨论
• 3 鱼类IL-2分子的研究
• 3.1 黑青斑河豚IL-2及IL-2L的克隆、鉴定及组织分布
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 基因组提取与检测
• 3.1.1.2 基因组PCR
• 3.1.1.3 TOPOT-A克隆与测序
• 3.1.1.4 基因预测
• 3.1.1.5 IL-2与IL-2L基因克隆
• 3.1.1.6 IL-2和IL-2L组织表达
• 3.1.2 结果与讨论
• 3.1.2.1 基因组PCR、测序与基因预测
• 3.1.2.2 基因克隆
• 3.1.2.3 基因结构
• 3.1.2.4 组织表达
• 3.2 黑青斑河豚IL-2,IL-2L原核表达与纯化
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 pET32b-IL-2表达质粒与菌株构建
• 3.2.1.2 原核表达
• 3.2.1.3 蛋白纯化
• 3.2.2 结果与讨论
• 3.3 IL-2与IL-2L,IL-21进化分析
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.2 结果与讨论
• 4 鱼类IL-15Rα分子的研究
• 4.1 黑青斑河豚IL-15Rα的克隆
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.1.1 基因预测
• 4.1.1.2 基因克隆
• 4.1.1.3 基因预测与克隆
• 4.1.1.4 基因组提取与基因组PCR
• 4.1.2 结果与讨论
• 4.2 黑青斑河豚IL-15Rα原核表达与纯化
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.1.1 pET41-dsIL-15Rα,pET41-ssIL-15Rα表达质粒与菌株构建
• 4.2.1.2 pET28a-ssIL-15Rα构建
• 4.2.1.3 原核表达
• 4.2.1.4 可溶性蛋白纯化
• 4.2.1.5 透析与蛋白质浓度测定
• 4.3 多抗制备与纯化
• 4.3.1 材料与方法
• 4.3.1.1 抗原制备
• 4.3.1.2 免疫过程
• 4.3.1.3 间接ELISA法测定抗血清效价
• 4.3.1.4 抗体纯化
• 4.3.2 结果与讨论
• 4.4 Western blot
• 4.4.1 材料与方法
• 4.4.1.1 试剂
• 4.4.1.2 方法
• 4.4.2 结果与讨论
• 4.5 GST-pull down
• 4.5.1 材料与方法
• 4.5.1.1 试剂
• 4.5.1.2 方法
• 4.5.2 结果与讨论
• 4.6 直接夹心法ELISA
• 4.6.1 材料与方法
• 4.6.1.1 试剂
• 4.6.1.2 方法
• 4.6.2 结果与讨论
• 4.7 虹鳟鱼IL-15Rα的克隆与鉴定
• 4.7.1 材料与方法
• 4.7.1.1 实验鱼
• 4.7.1.2 基因预测与电子克隆
• 4.7.1.3 基因克隆
• 4.7.1.4 组织分布
• 4.7.1.5 Southern blot
• 4.7.2 结果与讨论
• 5 脊椎动物IL-15Rα与IL-2Rα基因家族的进化研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 基因预测与共线性分析
• 5.1.2 基因序列比对
• 5.1.3 进化树构建
• 5.1.4 相对进化速率
• 5.1.5 基因协同进化
• 5.2 结果与讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 作者简历