大菱鲆受哈维氏弧菌感染后的基因差异表达研究

论文摘要

大菱鲆是一种非常名贵的海洋鱼种,它生长迅速并且味道十分鲜美,从而深受人们的喜爱。然而,目前鱼类的病害问题已成为限制海水鱼类养殖业可持续发展的主要因素,其中哈维氏弧菌是海水养殖动物（鱼、虾）的重要致病菌,给海水养殖业造成了巨大的经济损失。为解决养殖鱼的病害问题,增强养殖种类的抗病力,必须对病原菌和鱼类免疫系统之间的相互作用关系有全面的了解。然而,鱼类的许多免疫/抗病相关基因尚不清楚。由于大多数免疫/抗病相关基因并非组成型表达,而是受病原物感染影响的诱导型表达,因此如能分析免疫细胞基因在病原物感染时的差异表达,就有可能发现和鉴别新的免疫/抗病相关基因,并在分子水平上阐明免疫细胞和病原菌之间的相互作用关系。抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术是Diatchenko等以mRNA差别显示技术为基础建立起来的筛选未知的差异表达基因的新技术,它主要基于抑制PCR,并结合标准化（normalization）和消减杂交（subtractive hybridization,SH）技术。它克服了mRNA差异显示技术的假阳性高和代表性差别分析法的消减杂交轮次较多的缺点,十分适用于分析造成某种特殊表性的目的基因及其功能,从而成为差异表达基因筛选最有潜力的新方法。本文运用SSH技术比较了经哈维氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆差异表达基因。利用Trizol试剂分别从对照组和实验组中提取肾组织和脾组织的总RNA,将同一组的总RNA混合并分离、纯化mRNA,构建双向SSH差减文库,克隆差减片断,对阳性克隆片断测序分析及GenBank同源性检索。共鉴定出49个差异片段,通过与GenBank数据库的比对,发现这些基因片段大部分为免疫相关基因,包括主要组织相容性复合体基因、热激蛋白基因、信号蛋白基因等。其中,一个差异片段被证实为主要组织相容性复合体MHC classⅠa基因（登陆号EF032639）,通过RACE技术获得其全长的cDNA,测序并分析其编码产物的性质。该基因序列全长1466 bp,包含一个1062 bp的开放阅读框,编码354个氨基酸。5’UTR长127 bp ,3’UTR长277 bp,并且在3’UTR区poly-A尾1185 bp处含有一多聚腺苷酸信号序列ATTAAA。经比对后发现,MHC class Ia氨基酸序列与牙鲆、青鳉鱼、虹鳟、大西洋真鳕、红鳍东方鲀、鸡、鼠、和人的同源性分别为68%, 54%, 51%, 52%, 57%, 33%, 29%, 29%。荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积来检测PCR产物。实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。本文采用了SYBR Green I荧光染料,通过相对定量中的双标准曲线法,以大菱鲆看家基因β-actin为内参进行校正,比较了经哈维氏弧菌感染的和未受感染的大菱鲆中MHC class Ia基因的表达量的差异。结果显示,大菱鲆的MHC class Ia在受到哈维氏弧菌感染后表达量有所上升,表达量上升为原来的4倍,证明MHC class Ia在大菱鲆的免疫反应中发挥了作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 抑制性消减杂交技术
• 1.1.1 抑制性消减杂交技术基本原理
• 1.1.2 抑制消减杂交技术的操作过程
• 1.1.3 抑制消减杂交技术的特点
• 1.2 SSH 技术与其它差异显示技术的比较
• 1.2.1 限制性酶切片段差异显示技术
• 1.2.2 代表性差异分析
• 1.2.3 mRNA 差异显示技术
• 1.2.4 基因表达系列分析
• 1.2.5 cDNA 微阵列技术
• 1.2.6 SSH 技术与其它差异显示方法的比较
• 1.3 SSH 技术在鱼类免疫基因克隆中的应用
• 1.3.1 鱼类的白细胞介素（interleukins,ILs）基因
• 1.3.2 趋化因子（chemokine）基因
• 1.3.3 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）基因
• 1.3.4 溶菌酶（Lysozyme）基因
• 1.3.5 NK细胞增强因子（NKEF）基因
• 1.3.6 补体（complement component）基因
• 1.3.7 干扰素基因
• 1.4 本论文研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验动物和菌株来源
• 2.2 培养基
• 2.3 试剂和仪器
• 2.4 菌液制备
• 2.5 大菱鲆的感染和组织的获取
• 2.6 大菱鲆肾组织和脾组织总RNA 的提取
• 2.7 mRNA 的纯化
• 2.7.1 mRNA 的纯化准备
• 2.7.2 mRNA 的纯化步骤
• 2.8 差减cDNA 文库的建立
• 2.8.1 合成双链cDNA
• 2.8.2 cDNA RsaI 酶切
• 2.8.3 Tester cDNA 的制备——接头连接
• 2.8.4 二轮差减杂交
• 2.8.5 二轮差减 PCR 鉴定
• 2.9 差减文库克隆
• 2.10 斑点杂交
• 2.11 阳性克隆序列测序
• 2.12 RACE 技术扩增 MHC class Ia 全长
• 2.12.1 RACE 的原理和技术路线
• 2.12.2 RACE 步骤
• 2.12.2.1 引物的设计
• 2.12.2.2 反转录合成第一链
• 2.12.2.3 5’和3’RACE PCR 反应
• 2.12.2.4 RACE PCR 扩增片断的纯化与回收
• 2.12.2.5 RACE PCR 扩增片断的克隆
• 2.13 Real-time PCR
• 2.13.1 标准品的制备
• 2.13.2 定量 PCR 引物的设计
• 2.13.3 标准品和待测样品 Ct 值范围的校正
• 2.13.4 MHC class Ia 基因的Real-time PCR 表达分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 大菱鲆总RNA 的电泳检测
• 3.2 mRNA 纯度及浓度的检测
• 3.3 差减文库的构建
• 3.3.1 cDNA RsaI 酶切
• 3.3.2 Tester cDNA 接头连接效率的检测
• 3.3.3 消减效率的检测
• 3.4 差减文库的克隆鉴定
• 3.5 斑点杂交
• 3.6 阳性克隆片断的同源性分析
• 3.7 MHC class Ia 基因全序列扩增
• 3.7.1 MHC class Ia 基因的 3’RACE PCR 和5’RACE PCR 的扩增
• 3.7.2 MHC class Ia 序列分析
• 3.7.3 MHC class Ia 氨基酸序列同源性分析
• 3.8 Real-time PCR
• 3.8.1 Real-time PCR 标准品的制备
• 3.8.2 MHC class Ia 基因的Real-time PCR 表达分析
• 3.8.3 MHC class Ia 基因在实验组和对照组的相对表达量
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 附录 I 溶液配方
• 附录 II PCR primer1, adaptor1, adaptor2R和Rsa I酶切位 点序列
• 附录 IV 攻读硕士期间发表和撰写的文章
• 致谢