大白菜种质资源的病毒病（TuMV）抗性筛选鉴定及其SSR分子指纹技术的研究与应用

论文摘要

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）原产我国,又名结球白菜、白菜、黄芽菜。是一种具有中国特色的大众蔬菜,我国拥有最丰富的大白菜种质资源。本论文对667份大白菜种质资源材料的抗病毒病进行评价并建立了大白菜核心种质SSR指纹库技术,旨在为大白菜种质资源的保护和利用、抗病毒病微核心种质DNA指纹库的建立以及抗病育种的亲本选择提供重要的理论依据。主要研究结果如下:抗病性评价结果:表现高抗的材料有26份,占鉴定总数的3.9%;抗病材料78份,占鉴定总数的11.7%;耐病材料205份,占鉴定总数的30.7%;感病材料222份,占鉴定总数的33.3%;高感材料份136份,占鉴定总数的20.3%。形态性状调查发现,叶片深绿色、叶脉粗的直筒型品种比较抗病。仅根据主要形态特征,并不能把抗、感品种分开,部分品种的形态相似,但抗性表现差异很大。此外,利用RT-PCR技术,通过获得包含芜菁花叶病毒（TuMV）CP基因的cDNA片段,大小约为980bp,可以对田间大白菜病样进行快速检测。建立一套适用于大白菜SSR分析标准体系:即在10μL反应体系中,1×buffer;2.50mmol/L MgCl2;0.10mmol/L dNTPs;0.35μmol/L SSR引物;1.00 ng/μL模板DNA和0.40U Taq酶。扩增程序为72℃热启动3min,94℃预变性2min后进行20个迫降循环:94℃变性60s,68℃退火60s,72℃延伸45s（-1℃/2 cycles）;再进行20个循环:94℃变性60s,58℃退火60s,72℃延伸45s,于72℃延伸10min。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（银染）电泳检测。利用芸薹属SSR引物数据库和NCBI-EST数据库信息得到核心SSR引物52对。研究表明:EST-SSR标记是最高效、便捷、低廉的标记。并根据27对大白菜SSR引物扩增片段范围组成不同的组合进行多重PCR反应初步研究,在单一PCR相同的反应条件下,所有组合中能够正常扩增的有27个,其中18个两重PCR、8个三重PCR和1个四重PCR组合扩增稳定,表现稳定的多重组和可以作为复合标记应用于大白菜核心DNA指纹库构建研究中。用筛选到的部分引物在5份不同栽培地区的大白菜品种间的扩增结果,初步分析了SSR标记的多态性及用于大白菜品种指纹鉴定的潜力。其中引物Ra3-D04、Ra2-G09的鉴别能力最强,单独引物就可以鉴别出供试的5个品种;引物Ra3-H10、Bn-38A分别可以鉴别出2个和3个品种。依据形态标记和SSR分子标记对20份抗性不同的大白菜品种的遗传相似性分析结果和聚类树系图表明:整个试验成对品种的GS变幅分别在0.08～0.85和0.42～0.87范围内,大部份供试品种间的遗传基础比较远;有些在形态标记上距离很远的品种,在SSR分子标记上聚在一起;大多数抗性一致的品种的亲缘关系较近,但是也有抗性差异大的品种间的GS很大,表现出高度的相似性;不同抗性品种在基于形态性状和SSR标记建立的聚类树系图中分布情况不同,抗、感品种都呈现交叉分布;品种间的遗传差异与其抗性表现的关系并不十分明显。SSR技术是分析大白菜品种亲缘关系和遗传多样性的较理想方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 大白菜种质资源的研究进展
• 1.1.1 大白菜的起源进化与发展
• 1.1.2 大白菜种质资源的分布与现状
• 1.1.3 大白菜品种资源抗病毒病鉴定与评价
• 1.2 植物病毒病PCR 检测技术
• 1.3 遗传标记研究进展
• 1.3.1 主要遗传标记的类型与特点
• 1.3.2 简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记
• 1.3.3 表达序列标签（Expressed Sequence Tags，EST）微卫星标记
• 1.3.4 遗传标记在白菜类作物中的应用
• 2 本研究目的、意义和技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 大白菜种质资源病毒病的抗性筛选鉴定
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 自然病圃鉴定
• 3.1.3 形态性状调查
• 3.1.4 形态性状数据统计和分析方法
• 3.1.5 人工接种鉴定
• 3.1.6 病害调查方法、病情分级与抗性评价标准
• 3.2 大白菜SSR 指纹技术研究
• 3.2.1 供试材料
• 3.2.2 基因组DNA 提取
• 3.2.3 扩增体系的优化
• 3.2.4 扩增程序的优化
• 3.2.5 产物检测方法的优化
• 3.3 大白菜SSR 核心引物开发与筛选
• 3.3.1 基因组SSR 引物来源
• 3.3.2 表达序列标签SSR 引物来源与设计
• 3.3.3 SSR 引物筛选
• 3.4 大白菜多重SSR-PCR 反应研究
• 3.5 大白菜SSR 数据分析方法
• 3.6 主要仪器
• 3.7 主要溶液配制
• 4 结果与分析
• 4.1 大白菜种质资源的病毒病（TUMV）的抗性筛选鉴定
• 4.1.1 667 份大白菜种质抗性鉴定结果
• 4.1.2 TuMV 的RT-PCR 检测
• 4.1.3 ELISA 检测和PT-PCR 检测结果比较
• 4.1.4 主要抗源品种的抗性表现
• 4.1.5 主要抗感品种的形态性状表现
• 4.1.6 基于形态性状的主要抗感品种的聚类分析
• 4.2 大白菜SSR 指纹技术的建立
• 4.2.1 大白菜基因组DNA 提取
• 4.2.2 PCR 反应体系的优化
• 4.2.3 PCR 扩增程序的优化
• 4.2.4 PCR 产物检测的优化
• 4.3 大白菜SSR 核心引物筛选与确立
• 4.3.1 基因组SSR 引物筛选结果
• 4.3.2 表达序列标签SSR 引物开发及筛选结果
• 4.4 大白菜复合SSR 标记确定
• 4.4.1 SSR 引物分组
• 4.4.2 复合SSR 引物扩增结果
• 4.5 大白菜SSR 分析
• 4.5.1 大白菜品种SSR 鉴定
• 4.5.2 20 份大白菜抗感品种SSR 遗传相似性分析
• 4.6.3 基于SSR 分子标记的主要抗感品种的聚类分析
• 4.6.4 形态标记与SSR 标记分析的大白菜抗感品种聚类结果比较
• 5 讨论
• 5.1 关于大白菜种质资源抗病毒病鉴定
• 5.2 关于TUMV 的RT-PCR 的快速检测
• 5.3 关于不同检测方法在检测TUMV 中的应用
• 5.4 关于大白菜SSR 指纹技术建立
• 5.5 关于大白菜核心SSR 标记的确定
• 5.6 关于大白菜复合SSR 标记的初步研究
• 5.7 关于大白菜品种SSR 指纹鉴定
• 5.8 关于大白菜品种SSR 标记遗传多样性分析
• 5.9 关于不同标记方法对不同抗感品种聚类结果的影响
• 6 结论
• 致谢
• 图版
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介