论文摘要
原发性视网膜色素变性（Retina pigmentosa，RP）是一种目前临床上尚无有效治疗方法的严重致盲眼病。视网膜中最主要的神经胶质细胞—Müller细胞在这种病变过程中逐渐肥大、排列紊乱，与视网膜下腔无法正常降解的外节盘膜碎屑共同构成“胶质封闭”（glial seal），致使营养物质无法从脉络膜运输至视网膜，从而引起光感受器细胞的逐渐变性乃至凋亡。近年来发现在嗅觉系统中存在一种特殊类型的神经胶质细胞，称为嗅鞘细胞（Olfactory Ensheathing Cell，OECs），中枢神经损伤后移植混合的OECs和嗅球成纤维细胞（Olfactory nerve fibroblasts，ONFs），能够抑制胶质瘢痕，促进神经轴突再生。因此，本实验室选择了与RP病变过程相类似的皇家外科学院大鼠（RoyalCollege of Surgeon rat，RCS rat）作为研究对象，将OECs移植入视网膜下腔，针对OECs对Müller细胞胶质增生的影响进行研究。在前期研究中我们观察到：1.RCS-P+大鼠视网膜下腔移植OECs后，OECs能沿视网膜下腔及视网膜各层迁移。2.OECs移植后Müller细胞神经胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillary acidic protein，GFAP）的表达明显下降。3.OECs移植后RCS大鼠ERG b波幅值较对照组升高。这些实验结果提示：OECs在变性视网膜中同样具有抑制“胶质封闭”形成的作用。那么，移植至视网膜下腔的OECs如何降解视网膜下腔堆积的外节盘膜碎屑而在视网膜内迁移？迁移进入视网膜中的OECs与变性视网膜Müller细胞如何相互作用？OECs又是通过何种途径抑制Müller细胞胶质增生？尚有待进一步研究解决。在中枢神经损伤修复的研究中发现，OECs在中枢神经系统中迁移可能与释放MMPs有关。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是锌离子依赖性内切蛋白水解酶家族，具有高度保守性，能通过降解细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）发挥组织重构、新生血管生成、神经发生等作用，也可以促进肿瘤细胞的浸润和转移。因此，在RCS-P+大鼠视网膜下腔移植OECs后，OECs可能通过分泌MMPs在视网膜下腔及视网膜各层中迁移。Notch-Delta是一个在生物进化过程中古老而保守的信号传导系统，具有重要的作用。主要通过相邻细胞间的受体配体结合，实现细胞内信号转导和细胞核内转录，进而精确调控组织和细胞向不同方向分化。OECs移植后，同为神经胶质细胞的OECs与变性视网膜Müller细胞是否通过Notch-Delta信号相互抑制，目前尚未见报道。因此，我们假设：RCS大鼠视网膜下腔移植OECs后，OECs可能通过分泌MMPs迁移进入宿主视网膜与Müller细胞相互接触，通过下调Notch-Delta信号通路抑制Müller细胞胶质增殖反应。针对上述假设，进行如下研究：1. OECs分离自成年RCS-rdy+-P+（RCS-P+对照正常鼠）大鼠嗅球并进行原代培养，利用免疫细胞化学、ELISA等实验方法检测OECs在体外培养和在宿主体内MMPs家族分子的表达与分泌，并在不同时间点观察MMPs含量的变化。2.观察OECs移植对RCS大鼠视网膜Müller细胞胶质增生的特异性指标GFAP表达变化；激光共聚焦显微镜观察不同时间点OECs在宿主视网膜中的迁移情况及与Müller细胞的相互作用方式。3.利用免疫细胞化学、荧光定量PCR（RTFQ-PCR）等实验方法分别检测OECs以及RCS大鼠病变过程中Müller细胞Notch家族及其配体表达情况；并检测OECs移植后，对RCS大鼠视网膜Notch受体及其配体表达的影响。本研究主要结果如下：1. OECs在移植前后均能表达并分泌MMP-2/MMP-3：原代培养RCS-rdy+-P+大鼠嗅球来源的OECs，应用免疫细胞化学方法和ELISA方法，检测MMPs的表达与分泌以及在移植后不同时间点MMPs含量的变化。结果发现，（1）原代培养的RCS-rdy+-P+大鼠嗅球来源的OECs具有表达MMP-2/MMP-3的能力。（2）OECs培养液上清MMP-2/MMP-3含量在培养后5天与普通培养基无明显统计学差异（P>0.05），8天高于普通培养基（P<0.05），11天起至14天与普通培养基有显著统计学差异（P<0.01）。（3）在体实验中，将OECs移植至RCS大鼠视网膜下腔后7天时，MMP-2的含量在三组之间无明显差异（P>0.05）；14天时细胞移植组视网膜MMP-2的含量高于伪手术组（P<0.05）；21d及28d，细胞移植组视网膜MMP-2/MMP-3的含量显著高于伪手术组和未处理组（P<0.01）,另外两组间无统计学差异（P>0.05）。结果表明，成年RCS-rdy+-P+大鼠嗅球来源的OECs在离体条件下高表达MMP-2/MMP-3，并且能将MMP-2/MMP-3分泌至细胞外发挥生物学效应。移植至RCS大鼠视网膜后，OECs可能通过分泌MMP-2/MMP-3降解视网膜下腔堆积的外节盘膜碎屑与ECM迁移进入视网膜神经上皮层。2. OECs移植后，RCS大鼠视网膜Müller细胞GFAP表达下调，并且OECs与Müller细胞具有多种接触方式：利用携带增强绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescentprotein，EGFP）的HIV慢病毒（LV-EGFP）标记OECs，LV-EGFP-OECs移植至RCS大鼠视网膜下腔后，（1）免疫荧光方法观察移植后30天、60天RCS大鼠视网膜中Müller细胞GFAP的表达变化。（2）移植后7天、14天、21天和28天LV-EGFP-OECs在RCS大鼠视网膜中迁移情况。结果显示：（1）移植后30天及60天细胞移植组Müller细胞GFAP的表达水平明显低于伪手术组和未处理组。（2）移植后7天，LV-EGFP-OECs主要聚集在移植点周边，少部分迁移至外核层；14天时部分LV-EGFP-OECs迁移进入视网膜，大多数位于外核层，部分迁移至内核层；21天时，部分LV-EGFP-OECs迁移至移植点周边视网膜下腔，迁移进入视网膜的LV-EGFP-OECs大部分位于内丛状层；28天时，LV-EGFP-OECs更多的进入内丛状层，部分细胞迁移至神经节细胞层与神经节细胞相接触。而且LV-EGFP-OECs迁移至内核层和内丛状层时与Müller细胞有多种接触方式，包括胞体-胞体、胞体-突起以及突起-突起等。结果表明：OECs与Müller细胞通过直接接触的方式抑制RCS变性视网膜中Müller细胞的胶质增殖反应。3.在RCS大鼠视网膜变性高峰期时，视网膜中Notch-1含量显著升高，OECs移植后下调Notch-Delta通路抑制RCS大鼠视网膜Müller细胞的胶质增殖反应：（1）RTFQ-PCR法检测出生30天、45天、60天及90天RCS-P+大鼠及其对照RCS-rdy+-P+大鼠视网膜中Notch-1含量变化；（2）应用免疫细胞化学方法，检测成年RCS-rdy+-P+大鼠嗅球来源的OECs及变性前期（出生后8-10天）的RCS大鼠视网膜Müller细胞中Notch及其配体家族相关分子的表达；（3）RTFQ-PCR法观察OECs移植后，RCS大鼠视网膜中Notch及其配体家族mRNA的变化。结果显示：（1）Notch-1的含量在变性高峰（出生30天时）的RCS大鼠视网膜中显著升高（P<0.01）。（2）成年RCS-rdy+-P+大鼠嗅球来源的OECs高表达Notch-3受体；出生8-10天的变性前期的RCS大鼠视网膜Müller细胞高表达其配体Delta like-1（DLL-1）/Delta like-4（DLL-4）。（3）RTFQ-PCR显示，OECs移植到RCS大鼠视网膜后21天和28天，细胞移植组RCS大鼠视网膜Notch-3及DLL-4的mRNA含量显著低于伪手术组和未处理组（P<0.01），另外两组间无统计学差异（P>0.05）。Notch配体家族其他分子的mRNA水平的变化在三组之间无明显差异（P>0.05）。表明，RCS大鼠视网膜在变性高峰时（出生30天）高表达Notch-1；OECs移植后，在视网膜中迁移并进入内核层、内丛状层与Müller细胞相互作用后通过激活Notch信号的“旁侧抑制”机制，下调宿主视网膜中Notch-3及DLL-4的含量，抑制Müller细胞胶质增殖。综上所述，本课题验证了假设：即RCS大鼠视网膜移植OECs后，OECs通过分泌MMPs迁移进入宿主视网膜与Müller细胞相互接触，通过下调Notch-Delta信号通路下调RCS大鼠视网膜中Müller细胞的胶质增殖反应。
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