论文摘要
背景:成年哺乳动物脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）后的修复十分困难,所以一直是医学界关注的重点研究方向。1996年Marcia在权威杂志Science“脊髓损伤新概念”报道“脊髓损伤后继发性细胞死亡不是直接由于损伤而是由于细胞凋亡（Apoptosis）引起的”。这一新观点已将脊髓损伤研究大大推进一步。脊髓的原发性损伤被认为是不可逆转的,但是其后的继发性损伤却被认为是可逆转的,这为人们进行SCI再生修复的研究提供了可能。小胶质细胞（microglia,MG）在中枢神经系统约占胶质细胞的10-20%,活化的MG在中枢神经系统损伤后具有“双重效应”,既有保护性细胞行为,又有损害性细胞行为。鉴于上述,我们拟在动物实验基础上进行小胶质细胞培养、活化,对SCI模型进行活化MG移植,对SCI功能恢复进行评价,观察MG组织学形态变化,探索活化MG移植对脊髓损伤恢复的作用机制。目的:1、优化获取大鼠小胶质细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行研究,为活化小胶质细胞移植准备种子细胞;2、评价SCI后活化的小胶质细胞移植对大鼠脊髓功能恢复的作用;3、观察应用活化小胶质细胞移植后损伤脊髓的组织形态学变化规律;4、在大鼠SCI模型中,检测TGF-β1mRNA及其蛋白在移植后表达变化,探讨活化小胶质细胞移植促进SCI脊髓功能恢复的作用机制;方法:1、取新生SPF级别Wistar乳鼠,麻醉后取大脑半球、中脑及胼胝体,分成A组（常规对照组）、B组（机械振荡组）、C组（胰酶消化组）、D组（盐酸利多卡因诱导组）。采用McCarthy经典培养方法并结合营养丧失法、机械振摇法以及温和消化法,在盐酸利多卡因诱导活化下对混合胶质细胞纯化并对其进行传代培养,观察细胞形态、表面标志物的表达,从而对其进行鉴定;观察第2、4、6、8代小胶质细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线;2、成年雌性Wistar大鼠20只,随机分为2组,每组10只,分成A组（实验组）、B组（对照组）,采用改良Allen脊髓打击装置建立中度脊髓损伤的动物模型,取纯化的第2代小胶质细胞采用间接免疫荧光标记联合流式细胞仪检测细胞纯度,SCI造模后第7d采用微量注射器将纯化的小胶质细胞移植于A组模型动物脊髓损伤部位,B组注入0.9%生理盐水作为对照,术后不同时间点采用BBB评分系统和斜板试验观察大鼠下肢的功能,进行运动功能评分（BBB评分,斜板试验评分）,并进行运动诱发电位（MEP）检测,进行脊髓功能的评定及疗效的判断; 3、成年雌性Wistar大鼠52只,其中22只分别于SCI造模成功后各个时点随机处死2只大鼠,取脊髓损伤节段标本行组织冰冻切片,以OX42标记小胶质细胞行间接免疫荧光染色,观察其活性变化;将另30只分成两组,分成A组（MG移植组）、B组（对照组）,每组15只,SCI造模成功后第7d采用微量注射器将以Brdu标记的纯化小胶质细胞移植于A组大鼠脊髓损伤部位,B组则以注入0.9%生理盐水作为对照,分别在移植后各个时点取脊髓损伤节段标本进行HE染色观察、CD68和OX42分别标记小胶质细胞行间接免疫荧光染色观察和Naounenko-Feigin浸银法染色观察;4、采用RT-PCR及Western blot技术,检测SCI大鼠活化小胶质细胞移植组与对照组间不同时段损伤脊髓组织内TGF-β1mRNA及其蛋白表达变化,探索其在SCI中的作用机制。结果:1、经McCarthy经典培养方法并结合营养丧失法、机械振荡法、温和消化法,在盐酸利多卡因诱导活化下所得到的小胶质细胞纯度高,所分离培养的细胞CD68、OX42均呈阳性表达,纯度达到94.92±7.05%,明显高于对照组（常规对照组84.72±6.30%,机械振荡组88.14±6.11%,胰酶消化组90.63±7.04%）;纯化的小胶质细胞第2代和第4代细胞形态较单一,多在15-30min贴壁,快速增长期约为第3-6d,8小时有90%左右的细胞贴壁;第1代、第2代、第4代小胶质细胞增殖能力强,细胞生长旺盛;2、间接免疫荧光标记联合流式细胞仪检测结果显示第2代培养的小胶质细胞有97.8%表达CD68,有89.4%表达OX42,阳性率为（ 96.2±2.8） %,这表明细胞纯度约为（96.2±2.8） %;3、活化MG移植到SCI损伤区后,实验组与对照组比较,运动功能评分（ BBB ）A组（SCI后MG移植组）造模术后2、3、4、6、8w后肢运动功能评分较B组（SCI后未移植组）明显升高,差别有统计学意义（p﹤0.05）;斜板试验评分结果显示A组造模术后2、3、4、6、8w斜板试验测定角度较B组明显升高,差别有统计学意义（p﹤0.05）;运动诱发电位检测显示损伤后第4w记录到的波形发现:波形低钝,潜伏期延长,峰峰值减小,A组较B组改变更明显,差别有统计学意义（p﹤0.05）;第8w波形明显,但潜伏期仍延长,峰峰值仍减小,较第4w明显改善,且A组恢复明显,差别有统计学意义（p﹤0.05）,与运动功能评分结果基本相符;4、活化MG移植于SCI大鼠受损脊髓,1w内其生长情况良好,并于受损脊髓区聚集,并至少持续存活2w;细胞免疫荧光染色观察中发现SCI后MG活化（OX42标记）分别于损伤后1-3h和损伤后24-48h呈现两个高峰,至第5d开始出现小胶质细胞活化程度逐渐减弱,至第7d小胶质细胞活化荧光强度恢复至静息状态水平。活化MG移植后（OX42标记）在24h内保持较高的活性,免疫荧光强度较强,其荧光强度持续到移植后2w,在移植后第3-4w,移植小胶质细胞的活性仍然存在,但其荧光强度开始出现下降;移植组免疫荧光强度与对照组差别均有统计学意义（p<0.05）;CD68标记活化小胶质细胞移植与OX42标记的小胶质细胞移植有相似的结果,移植组较对照组差别均有统计学意义（p<0.05）;浸银染色观察发现,活化MG移植于脊髓受损区后第2d该区即开始出现活化小胶质细胞数增高,并且移植后7d内小胶质细胞计数达峰值,持续到7d-14d,移植后于第3-4w亦有活化小胶质细胞存在,数量逐渐减少。各时点移植组小胶质细胞银染阳性细胞数与对照组比较差别均有统计学意义（p<0.05）;5、SCI大鼠MG移植术后48h、1w、2w、3w受损区脊髓内都有TGF-β1mRNA及其蛋白表达,高表达维持2w左右;对照组48h、1w、2w、3w有TGF-β1mRNA及其蛋白表达,表达量明显低于移植组（p<0.01）。结论:1、盐酸利多卡因法分离培养的细胞为小胶质细胞且成分单一,第2代、第4代细胞很纯且其增殖能力强,适用于做下一步移植研究;2、活化小胶质细胞移植到SCI大鼠脊髓损伤区,可有效促进大鼠后肢运动功能的恢复;3、活化小胶质细胞移植到脊髓损伤区后,小胶质细胞在脊髓损伤节段可以长时间驻存（2-4w）,形态学上支持MG移植促进损伤脊髓功能恢复的观点;4、活化小胶质细胞移植到SCI大鼠脊髓损伤区,可以上调损伤脊髓TGF-β1mRNA及蛋白的表达;活化小胶质细胞移植后,脊髓内TGF-β1蛋白的高表达可能是脊髓损伤修复的重要机制之一;活化的小胶质细胞可能是TGF-β1的主要来源。