磷脂酶A2在SD大鼠NAFLD肝细胞脂性凋亡中的作用机制研究

论文摘要

研究背景非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是指除外酒精和其他明确的肝损因素所致的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合症,包括非酒精性单纯性脂肪肝以及由其演变的非酒精性脂肪肝炎和肝硬变,肝细胞脂性凋亡是NAFLD最具特征的病理表现。研究发现体内游离脂肪酸（FFA）的代谢失衡是导致脂肪肝的最主要原因,特别是FFA介导的肝细胞的过度脂性凋亡是NAFLD发生发展的关键,但其确切发病机制尚不明了。近年来研究表明：NAFLD,患者肝脏内大部分的FFAs是进入非氧化代谢途径而非传统的p氧化途径,非氧化代谢产生的活性脂肪酸衍生分子可能是导致肝细胞脂性凋亡的关键因素。FFAs向磷脂酸／二酰基甘油（DAG）途径进行代谢更容易导致肝细胞脂性凋亡,升高的DAG在胆碱磷酸转移酶等催化作用下迅速合成磷脂酰胆碱（PC）,进一步激活磷脂酶,溶解细胞膜中的磷脂酰胆碱而释放出溶血磷脂酰胆碱（LPC）,而LPC是氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的重要脂质成分,是引起多种细胞凋亡的关键分子。所有磷脂酶中只有磷脂酶A2 （PLA2）专一水解甘油磷脂2-酰酯键,产生溶血磷脂和游离脂肪酸。那么PLA2/LPC代谢途径在肝细胞脂性凋亡中是否起重要作用,PLA2或其某一亚型的异常活化是不是其关键性的分子事件,目前不清楚。本研究通过建立高脂饮食诱导的SD大鼠NAFLD模型,模拟人体内的发病过程,通过分析在体肝细胞的基本病理变化（脂质聚集、凋亡程度、电镜形态）与PLA2及其亚型（sPLA2、cPLA2、iPLA2）表达水平、酶活性等变化的关系；进一步通过分析PLA2抑制剂（药物阻断技术）对肝细胞脂性凋亡的影响,以揭示PLA2在FFA致肝细胞脂性凋亡过程中的作用。因此,本项目将初步阐明FFA致肝细胞过度脂性凋亡的具体分子机制,为临床NAFLD的防治提供新的靶点和思路。目的分析NAFLD大鼠模型肝细胞的基本病理变化与PLA2及其亚型的关系及PLA2抑制剂（药物阻断技术）对肝细胞脂性凋亡的影响,以揭示PLA2在FFA致肝细胞脂性凋亡过程中的作用。方法把52只雄性SD大鼠,质量150～170 g,鼠龄4-6 wk。随机分成6组：普通饮食喂养组（Ⅰ组）12只喂养18周,空白高脂饮食喂养组（Ⅱ组）8只、钙依赖性和非钙依赖性PLA2总体抑制剂（MAFP）干预组（Ⅲ组）8只、胞浆型PLA2抑制剂（ACCOCF3）干预组（Ⅳ组）8只、钙非依赖性PLA2抑制剂（BEL）干预组（Ⅴ组）8只、分泌型PLA2抑制剂干预组（Ⅵ组）8只,Ⅱ～Ⅵ组高脂喂养14周后分别予以二甲基亚砜（DMSO）、MAFP、ACCOCF3、BEL、sPLA2抑制剂腹腔注射,隔天1次,共14次。喂养结束同时处死。测定大鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）、脂蛋白a（LPa）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）、游离脂肪酸（FFA）、胞浆型磷脂酶A2 （c PLA2）、分泌型磷脂酶A2 （sPLA2）、钙非依赖性磷脂酶A2 （iPLA2）、瘦素（Leptin）等指标,检测肝各类PLA2mRNA的表达,在光镜下观察大鼠肝脏形态学改变,在透射电镜下观察肝细胞、线粒体及其他细胞外基质的超微结构变化。结果与普通饮食喂养组比较高脂饮食组病理结果存在明显的脂肪变性及凋亡,电镜下可见线粒体肿胀脊紊乱,内质网脱颗粒,血cPLA2及iPLA2浓度明显增高,同时肝cPLA2、iPLA2 mRNA表达明显增高；各干预组之间比较iPLA2及cPLA2抑制剂处理组肝细胞的凋亡较其他各组有所减少,线粒体的损伤也较轻。而且在FINS、HOMA-IR、IAI、瘦素、血cPLA2、血iPLA2有统计学差异（p≤0.05）。同时两两比较发现cPLA2抑制剂干预组的血清瘦素浓度明显低于各组,有统计学意义（p≤0.05）；iPLA2抑制剂干预组的FINS、HOMA-IR较其他各组下降,IAI较其他各组上升,有统计学意义（p≤0.05）。结论PLA2在NAFLD模型大鼠中表达明显升高,升高的PLA2主要是iPLA2及cPLA2,降低iPLA2及cPLA2可减少肝细胞的凋亡,降低iPLA2可改善胰岛素抵抗,而降低cPLA2可改善高瘦素血症。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目次
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 动物模型饲养条件
• 2.2 药品
• 2.3 主要仪器和设备
• 2.4 主要试剂
• 2.5 实验分组及实验流程
• 2.6 大鼠血清检测
• 2.7 肝脏磷脂酶A2基因检测
• 2.8 NAFLD的病理学诊断
• 2.9 统计学方法
• 3 结果
• 3.1 普通饮食喂养组（Ⅰ组）与空白高脂饮食喂养组（Ⅱ组）比较
• 3.2 空白高脂饮食喂养组（Ⅱ）与各类PLA2抑制剂处理后的高脂饮食喂养（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ）比较
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 作者简历
• 在学期间发表的文章