纳豆菌发酵产纳豆激酶及与红曲菌共培养的初探

论文摘要

从不同产地的纳豆样品中分离得到10株纳豆菌，对所得纳豆菌的菌落形态特征及菌体特征进行观察。其中纳豆菌BN-7产纳豆激酶活力相对最高，测定其生理生化特征后，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。研究BN-7种子的生长曲线，确定接入发酵培养基的种龄为18h。由单因子实验可知：纳豆菌BN-7液态发酵产纳豆激酶的相对最佳碳源为木糖，相对最佳氮源为大豆蛋白胨，培养温度为30℃，发酵周期为3d。Plackett-Burman法优化实验表明：木糖浓度、大豆蛋白胨浓度以及Na2HPO4浓度对纳豆激酶的酶活力有显著影响作用。响应面法优化后的工艺条件为：木糖2．02％、大豆蛋白胨3．06％、Na2HPO40．67％、NaH2PO40．1％、MgSO40．05％、CaCl2 0．02％，初始pH值为7．0，转速150 r／min，30℃培养72h。按照此条件发酵，纳豆激酶活力可达1025IU／ml，比优化前提高了约40％。纳豆菌BN-7相对最佳固态发酵工艺：黄豆含水率50％，物料厚度2cm，添加1％葡萄糖和0．05％FeSO4，接种量为8％，发酵12h后补加0．05％聚乙二醇，35℃培养24h。此条件下纳豆菌BN-7固态发酵产纳豆激酶活力可达1426IU／g。对纳豆菌BN-7和红曲菌GM011共培养进行了初步探索。结果表明红曲菌GM011不能在纳豆菌发酵培养基中正常生长；在红曲菌发酵培养基中混合培养，红曲菌GM011菌丝体生长不会受到很大影响，但是纳豆菌BN-7不能正常生长。在红曲菌发酵培养基中，于GM011发酵15天后以4％的接种量接入BN-7种子液，继续培养3d，采用此种培养方式，发酵结束后发酵液中Monacolin K含量为339mg／L，纳豆激酶活力为113IU／ml。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 纳豆激酶的研发现状
• 1.1.1 纳豆激酶的分子生物学
• 1.1.2 纳豆激酶的生理生化特性
• 1.1.2.1 纳豆激酶的分子结构
• 1.1.2.2 纳豆激酶的底物特异性
• 1.1.2.3 纳豆激酶的稳定性
• 1.1.3 目前常见纳豆激酶活力测定方法
• 1.1.3.1 琼脂糖—纤维蛋白平板法
• 1.1.3.2 纤维蛋白块溶解时间法
• 1.1.3.3 四肽底物法
• 1.1.3.4 血清板法
• 1.1.3.5 酶联免疫吸附法
• 1.1.4 常见溶栓剂作用机理的比较
• 1.1.4.1 血栓的形成和溶解
• 1.1.4.2 常见溶栓物质作用机制及其特点
• 1.1.5 纳豆激酶发酵过程研究现状
• 1.1.6 纳豆激酶分离纯化过程研究现状
• 1.2 红曲菌概述
• 1.2.1 红曲菌的生物学特性
• 1.2.1.1 红曲菌的生活史
• 1.2.1.2 红曲菌的分类
• 1.2.2 降血脂红曲的研究进展
• 1.2.2.1 红曲菌产降胆固醇物质的简介
• 1.2.2.2 红曲菌产Monacolin K的国内外研究现状
• 1.3 本论文的研究内容、目的和意义
• 1.3.1 主要研究内容
• 1.3.2 研究目的和意义
• 第二章 产纳豆激酶纳豆菌的分离筛选及其特性研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 培养基及培养方法
• 2.2.4 实验方法
• 2.2.5 种子的生长曲线
• 2.2.6 纳豆激酶活力测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 尿激酶标准曲线
• 2.3.2 所分离纳豆菌菌落形态及菌体观察
• 2.3.3 产纳豆激酶纳豆菌的筛选
• 2.3.4 BN-7生理生化特征测定
• 2.3.5 BN-7的生长曲线
• 2.4 小结
• 第三章 液态发酵产纳豆激酶工艺条件的优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 培养基及培养方法
• 3.2.3 纳豆激酶活力的测定
• 3.2.4 不同碳源对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.2.5 不同氮源对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.2.6 培养温度对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.2.7 培养时间对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.2.8 响应面法实验设计
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 碳源对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.3.2 氮源对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.3.3 培养温度对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.3.4 培养时间对发酵产纳豆激酶的影响
• 3.3.5 Plackett-Burman法筛选影响产酶的重要因素
• 3.3.6 最陡爬坡实验
• 3.3.7 中心组合实验
• 3.4 小结
• 第四章 固态发酵产纳豆激酶工艺条件的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验菌种
• 4.2.2 培养基及培养方法
• 4.2.3 固态发酵纳豆激酶的提取
• 4.2.4 纳豆激酶活力的测定
• 4.2.5 物料含水量对发酵产酶的影响
• 4.2.6 基质厚度对发酵产酶的影响
• 4.2.7 接种量对发酵产酶的影响
• 4.2.8 不同后熟时间对发酵产酶的影响
• 4.2.9 添加不同碳源对发酵产酶的影响
• 4.2.10 金属离子对发酵产酶的影响
• 4.2.11 表面活性剂对发酵产酶的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 物料含水量对发酵产酶的影响
• 4.3.2 基质厚度对发酵产酶的影响
• 4.3.3 接种量对发酵产酶的影响
• 4.3.4 不同后熟时间对发酵产酶的影响
• 4.3.5 添加不同碳源对发酵产酶的影响
• 4.3.6 金属离子对发酵产酶的影响
• 4.3.7 表面活性剂对发酵产酶的影响
• 4.4 小结
• 第五章 纳豆菌和红曲菌共培养的初探
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 纳豆菌BN-7和红曲菌GM011共培养方式的确定
• 5.2.4 纳豆激酶活力的测定
• 5.2.5 Monacolin K的检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 Monacolin K标准品液相色谱图
• 5.3.2 BN-7和GM011种子液同时接入纳豆菌发酵培养基中
• 5.3.3 GM011种子液接入BN-7发酵液中
• 5.3.4 BN-7种子液接入GM011发酵培养基中
• 5.4 小结
• 第六章 结论与展望
• 参考文献
• 附录一: 实验所用试剂
• 附录二: 实验所用仪器设备
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录