论文摘要
背景及目的自上世纪以来,手术、放疗和化疗作为传统三大方法,对恶性肿瘤的治疗已取得较好的疗效。但是这些治疗手段并非对所有肿瘤都有效,且有的伴有明显的副作用。比如在急性髓系白血病的治疗实践中,化疗已取得良好的治疗效果,但仍有15%-20%患者未达到完全缓解,即使在达到完全缓解的患者中,仍有部分由于化疗所致的毒副作用而死亡,且微小残留病变所致的复发使再次治疗难度加大。因此,寻找损伤小又能有效控制肿瘤的方法,成为肿瘤临床治疗的迫切需求。随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透,肿瘤免疫治疗研究突飞猛进,以免疫学原理为基础、免疫学技术为方法而建立起来的肿瘤免疫治疗,已经从实验室研究逐渐向有效、安全的临床试验过渡。随着对机体抗肿瘤特异性免疫应答的深入了解,以及对肿瘤免疫逃逸机制和肿瘤微环境的深入认识,肿瘤免疫治疗的新策略和新思路己得到进一步的研究、拓展。肿瘤的难治性和复发与肿瘤细胞逃避免疫攻击密切相关。目前已认识到的肿瘤免疫逃逸机制主要有以下几个方面：（1）肿瘤抗原表达缺陷/抗原调变,逃避宿主免疫攻击；（2）肿瘤细胞MHCⅠ类分子表达下降或缺如,使机体NK等免疫细胞对其的杀伤作用减弱,另外也与肿瘤的转移相关;（3）肿瘤细胞分泌负性调节细胞因子,如TGF-β、IL-10、VEGF等,抑制T细胞的分化,促进Th1-Th2平衡向Th2漂移,并下调T细胞黏附或/和共刺激分子的表达,诱导对肿瘤特异性CTL的耐受。最新研究表明,肿瘤细胞可通过分泌Sema3A抑制DC细胞的成熟和免疫学功能；（4）表达FasL的肿瘤细胞能诱导表达Fas的淋巴细胞发生凋亡,而肿瘤细胞本身Fas表达下调,使淋巴细胞促肿瘤细胞凋亡的作用减弱；（5）肿瘤细胞表面黏附分子/共刺激分子的表达往往缺陷,使得T细胞活化过程中缺乏第二信号而不能被有效激活,而某些负性调控共刺激分子如B7-H4等则表达上调；（6）肿瘤细胞可诱导多种抑制性免疫细胞亚群在肿瘤局部聚集和扩增,与肿瘤的发生发展密切相关。包括近年来被广泛研究的调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg）,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages, TAM）,髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derive suppressor cells,MDSC）等；（7）肿瘤抗原可诱导机体产生免疫耐受。当然,肿瘤细胞免疫逃逸的机制非常复杂,有些机制尚需进一步研究,且几种不同的机制常具有协同作用。只有深入了解肿瘤细胞如何逃避免疫攻击的机制,才能在设计和实施特异性免疫治疗的方案上取得突破。根据肿瘤细胞逃避免疫攻击的机制而设计出的免疫治疗方法,目前主要包括特异性主动免疫治疗和被动免疫治疗。前者主要指肿瘤疫苗,可刺激机体产生针对肿瘤抗原的特异性免疫应答,包括肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、以树突状细胞（Dendritic cells,DC）为基础的疫苗以及核酸疫苗等。后者指各种单克隆抗体和过继性细胞免疫治疗。究其本质,肿瘤疫苗的主要目的是筛选特异性的、免疫原性较强的肿瘤抗原来免疫宿主,提高宿主对肿瘤抗原的识别及产生特异性免疫应答,以克服肿瘤细胞逃避免疫攻击,达到杀死肿瘤细胞的作用。因此,如何筛选出免疫原性较强的、特异性的肿瘤抗原,是设计肿瘤疫苗的关键,也是目前肿瘤疫苗发展的限制所在。本实验采用小鼠肥大细胞瘤P815细胞作为抗原皮下免疫BALB/c小鼠,探讨其是否可诱导BALB/c小鼠产生较强的、针对P815细胞的特异性免疫应答,为肿瘤疫苗设计筛查抗原提供基础。方法小鼠肥大细胞瘤P815细胞经尾静脉注入BALB/c小鼠,实验按每只小鼠注入细胞数分为1×107/只组、5×106/只组、2.5×106/只组、1×106/只组、5×105/只组、1×105/只组和溶剂（RPM 11640培养液）对照组,每组6只小鼠。观察各组小鼠的生存状态、体重及肝肺脾（重量、形态、病理）、血涂片、骨髓涂片、白细胞及血小板计数变化。第二章皮下注入P815细胞对BALB/c小鼠形成肥大细胞瘤/白血病的影响实验分为4组,即P815细胞组、米托蒽醌处理的P815细胞组、L1210细胞组、溶剂对照组,每组6只BALB/c小鼠,分别于双侧臀部皮下注入P815细胞悬液（PBS液配制,0.5ml/只,细胞数5×106/只）、0.1ug/ml米托蒽醌作用12小时的P815细胞悬液（PBS液配制,0.5ml/只,细胞数5×106/只）、L1210细胞悬液（PBS液配制,0.5ml/只,细胞数5×106/只）和PBS液0.5ml/只。一周后,4组小鼠均尾静脉注入P815细胞悬液1.5×106/只（RPMI1640培养基配制,0.15ml/只）。观察各组小鼠生存时间、血涂片、体重及肝肺脾变化,评定各组小鼠形成肥大细胞瘤/白血病情况（观察期限为尾静脉注入P815细胞后3个月）。第三章皮下注入P815细胞诱导BALB/c鼠产生特异性抗肿瘤免疫效应实验分为2组。随机抽取第二章实验中尾静脉注入P815细胞后未死亡的BALB/c小鼠3只设为实验组,新购买的3只BALB/c小鼠设为对照组。对照组小鼠双侧臀部皮下注入0.5mlPBS液一周后,和实验组小鼠一起,颈椎脱臼法处死。无菌取脾脏,制备脾细胞悬液。乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测两组小鼠脾细胞分别对P815细胞、L1210细胞的杀伤率。观察两组小鼠脾细胞对P815细胞克隆形成的影响。实验各重复3次。各章实验数据用均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS13.0软件进行统计分析,各组小鼠体重、肝脾肺重、白细胞和血小板计数采用单向方差分析比较,方差齐时用LSD法行多重比较,方差不齐时用校正F值的Welch法检验及Dunnett T3法行多重比较。各组小鼠生存时间用Kaplan-Meier法行生存分析。两组脾细胞对P815细胞、L1210细胞的杀伤率和克隆影响采用两独立样本t检验和两因素两水平析因设计资料的方差分析进行比较。P<0.05表示差异有统计学意义。结果第一章BALB/c小鼠肥大细胞瘤/白血病模型的建立注入P815细胞≥1×106/只的所有组小鼠均死亡,<1×106/只的所有组小鼠均生存良好,在1×106/只组中有2只在第12-15天之间出现双后肢活动乏力,并逐渐瘫痪、僵硬,随后死亡。经Kaplan-Meier法（Log rank）生存分析,死亡各组（1×107/只组、5×106/只组、2.5×106/只组、1×106/只组）小鼠生存时间总体上有显著性差异（x2=42.601,P<0.001）；多重比较亦都有显著性差异（P<0.05）。1×107/只组、5×106/只组、2.5×106/只组、1×106/只组小鼠中位生存时间分别为7.0天,9.5天,10.5天,17.5天,可见小鼠注入P815细胞数越多,生存时间越短。死亡各组小鼠体重较未死亡各组小鼠减轻（F=29.235,P<0.001）、肝肺脾重显著增加（F值分别为46.939、14.940、31.995,相应P值均<0.001）,白细胞和血小板计数降低（F值分别为8.707、23.018,相应P值均<0.001）；肝质地变硬,表面可见大量大小不一的白色结节突起,部分脾肺可见出血灶,病理示肝脾有大量大小不一,形态不规则的异形细胞侵润；血涂片可见少量肥大细胞瘤细胞,骨髓涂片示骨髓原始细胞比例增高。第二章皮下注入P815细胞对BALB/c小鼠形成肥大细胞瘤/白血病的影响观察3个月,P815细胞组中有4只小鼠存活,另2只于尾静脉注入P815细胞后14天、17.5天死亡；米托蒽醌处理的P815细胞组中有5只小鼠存活,1只于尾静脉注入P815细胞后17天死亡。L1210细胞组和溶剂对照组小鼠分别于尾静脉注入P815细胞后12天至18.5天之间全部死亡。经Kaplan-Meier法（Log rank）生存分析,各组小鼠生存时间总体上有显著性差异（x2=16.585,P=0.001）；多重比较示P815细胞组、米托蒽醌处理的P815细胞组小鼠较L1210细胞组、溶剂对照组小鼠生存时间显著延长,差异均有统计学意义（P<0.05）,P815细胞组与米托蒽醌处理的P815细胞组间、L1210细胞组与溶剂对照组间均无显著性差别（P>0.05）。P815细胞组、米托蒽醌处理的P815细胞组中未死亡小鼠体重较L1210细胞组、溶剂对照组小鼠均显著增加（F=41.467,P<0.001）,肝肺重减轻（F值分别为13.283、5.658,相对应P值分别为<0.001、0.007）,脾重无明显差别（F=1.067,P=0.389）,血涂片及肝肺脾病理正常。所有组中死亡小鼠血涂片和肝肺脾病理同第一章肥大细胞瘤/白血病模型小鼠表现,结合生存时间、体重及肝肺脾重变化,可证明小鼠死于肥大细胞瘤/白血病。第三章皮下注入P815细胞诱导BALM小鼠产生特异性抗肿瘤免疫效应实验组与对照组小鼠脾细胞在形态上没有明显差别。实验组小鼠脾细胞以10：1或20：1的效靶比作用于P815细胞,对其的杀伤率均显著高于对照组小鼠脾细胞（t值分别为11.717,15.484,P值均<0.001）,实验组小鼠脾细胞以10：1或20：1的效靶比对L1210细胞的杀伤率与对照组小鼠脾细胞相比均无明显差别（t值分别为0.037,1.449,P值分别为0.972,0.221）,可见实验组小鼠脾细胞对P815细胞的杀伤作用具有特异性。实验组与对照组小鼠脾细胞相比,不管以20：1或50：1的效靶比与P815细胞共培养,对P815细胞克隆形成能力的抑制作用均显著增强（t分别为-11.538,-6.886,P值均<0.001）。结论1.P815细胞经尾静脉注入,可使BALB/c小鼠产生肥大细胞瘤/白血病。该肿瘤模型的主要生物学特征为：①静脉注入≥1×106个P815细胞才可形成,且注入细胞数越多,小鼠生存时间越短②P815细胞主要侵润肝、脾、神经系统③接种P815细胞后,外周血白细胞数轻度降低,为低增生性白血病,血小板亦降低,血细胞涂片可见少量P815细胞,骨髓细胞学涂片示原始细胞比例增高。2. BALM小鼠皮下注入P815细胞或米托蒽醌处理的P815细胞,均可诱导小鼠脾脏产生较强的、特异性杀伤P815细胞的淋巴细胞,从而对后续尾静脉侵入的P815细胞产生杀伤作用,使小鼠不形成肥大细胞瘤/白血病而生存。而皮下注入L1210细胞和PBS液的小鼠不能诱导产生此种杀伤作用,后续尾静脉侵入的P815细胞使小鼠形成肥大细胞瘤/白血病而死亡。由此可见,这种杀伤作用的产生也是特异性的。本课题的创新点：1.建立了BALB/c小鼠肥大细胞瘤/白血病模型并首次阐述了该模型的主要生物学特征。2.首次证实了皮下注入P815细胞可诱导BALB/c小鼠产生特异性的、较强的抗P815细胞免疫反应。本课题的研究价值：1. BALB/c小鼠肥大细胞瘤/白血病模型的建立及其主要生物学特征的阐述,为从事肿瘤研究工作者提供了一种肿瘤建模模型。2.皮下注入P815细胞可诱导BALB/c小鼠产生特异性的、较强的抗P815细胞免疫反应,证明了P815细胞自身抗原免疫原性较强,可筛选P815细胞上免疫原性较强的抗原制备肿瘤疫苗。本课题的不足：P815细胞来源于DBA/2小鼠,与BALB/c小鼠是同种异体。P815细胞通过尾静脉注射可在BALB/c小鼠体内成瘤,说明两者基因相差很小。但这些相差很小的基因抗原在本实验中亦产生了抗肿瘤免疫效应,它们相对BALB/c小鼠来说是异种抗原,对肿瘤疫苗的研究意义不大。如果这部分抗原产生的抗肿瘤免疫效应足够强大,那么本实验的研究价值将需重新评估。