论文摘要
肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一,也是全球发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤。在世界大多数国家,肺癌的患病率和死亡率呈逐年上升的趋势,尤其是发达国家,肺癌在男性常见的恶性肿瘤中居首位。尽管目前对于肺癌的诊断和治疗方法较过去都有了很大的提高,但肺癌的早期诊断困难、术后复发及转移率高仍严重困扰着广大患者和医务人员,这就迫切需要从预防入手,从根源上控制这种对人类威胁极大的疾病。而要采取有效的预防措施,就必须深入了解肺癌发生的病因。虽然肿瘤的发生是环境因素和体内遗传因素相互作用的结果,但从总体上来看,环境因素仍是致癌的主要原因。据报导,80%～90%的人类癌症与环境中的理化因素有关,其中又以化学因素致癌为主。重金属钒（Vanadium）是诱发肺癌的一种重要环境物质,其在工业上广泛使用并被释放到环境中。工业生产场所附近的土壤和植物中检测到的钒浓度明显升高。环境中绝大多数的钒是由钢铁工业所产生的,其它常见的接触钒的职业还包括:瓷器的染色、硫酸生产以及锅炉制造等等。钒具有强大的毒性与致癌性,其通过呼吸道途径进入体内可以直接对肺造成损伤。大量流行病学资料显示,人体长期暴露于钒化物时,肺癌的发生率明显升高,但钒促肺癌的机制目前尚不十分清楚,细胞的异常生长被认为在这一过程中起重要作用。所以,钒的致癌毒性与肺癌发病机制之间的关系仍值得深入探讨。环氧合酶2（Cyclooxygenase-2,COX-2）是一种前列腺素合成酶,主要作用是催化花生四烯酸（Arachidonic Acid）转化为前列腺素H2（Prostaglandin H2,PGH2）,其在绝大多数组织中并不表达,但可以由有丝分裂原或者致炎因子等所诱导产生。许多研究证实,COX-2在肺癌的发生过程中起着非常重要的作用,不仅与肺癌的发病相关,而且其表达水平的高低与肺癌患者的预后以及对于放、化疗的反应也密切关联。进一步研究发现,COX-2在肺癌等癌症发病中的作用主要通过其产生的细胞抗凋亡作用,使得受损伤的细胞不能发生正常的程序性死亡,从而出现恶性转变的倾向。其具体的抗凋亡机制主要涉及Bcl-2表达增加、凋亡抑制蛋白survivin表达增加等等。基于以上研究现状,我们提出这样的问题:钒是否能够诱导人支气管上皮细胞的COX-2表达?如果能够,是通过何种信号途径介导的?这些问题相关的研究国内外目前鲜有报道。本研究则是以钒在自然界中存在最多的形式—五氧化二钒为诱导物,刺激人支气管上皮细胞系Beas-2B细胞,并观察COX-2表达的变化、相关的信号转导途径以及可能引起的生物学转变。第一部分钒以NFAT活化依赖的途径诱导支气管上皮细胞的COX-2表达本部分实验以五氧化二钒为诱导物,观察经其刺激的人支气管上皮细胞系Beas-2B内COX-2在转录水平、蛋白表达水平上的变化,探讨五氧化二钒引起支气管上皮细胞中COX-2表达变化的转录因子。首先用不同浓度五氧化二钒对Beas-2B细胞刺激不同时间,并对处理后的各组细胞抽提总RNA,对等量的RNA进行RT-PCR,通过琼脂糖凝胶电泳观察细胞内COX-2的mRNAT水平变化。其次,用COX-2荧光素酶报告质粒稳定转染Beas-2B,通过荧光素酶活性检测明确不同剂量、不同时间段五氧化二钒处理后的细胞中COX-2蛋白表达水平的变化;对不同浓度钒处理后的Beas-2B细胞进行COX-2的Western blot检测,进一步明确钒对于Beas-2B细胞中COX-2表达的影响。为进一步研究COX-2表达的信号转导途径,我们选择NFAT作为靶点,同样使用NFAT荧光素酶报告质粒稳定转染Beas-2B细胞,通过荧光素酶活性检测明确不同剂量、不同时间段五氧化二钒处理后细胞中NFAT的活化程度。最后,为明确NFAT活化对于钒诱导Beas-2B细胞中COX-2表达的必要性,我们使用DN-NFAT真核表达质粒阻断Beas-2B细胞中NFAT的活化,再通过报告基因检测的方法明确钒处理后COX-2表达水平的变化。本部分实验结果显示:五氧化二钒能够以时间和剂量依赖性的方式上调Beas-2B细胞内COX-2的转录;对COX-2的报告基因检测以及针对COX-2的Western blot检测均证实:五氧化二钒能以时间和剂量依赖的方式诱导Beas-2B中COX-2蛋白的表达;同样利用NFAT报告基因检测的方法证实:五氧化二钒也能以时间和剂量依赖的方式诱导Beas-2B细胞内的NFAT活化;当DN-NFAT阻断了Beas-2B中NFAT的活化后,钒诱导的COX-2表达水平明显下降,提示钒诱导Beas-2B细胞中COX-2的表达是依赖于NFAT活化的。总之,本部分实验证实了五氧化二钒可以通过NFAT活化依赖的途径诱导支气管上皮细胞中COX-2的表达,且这种诱导呈现时间和剂量的依赖性。第二部分钒诱导支气管上皮细胞中表达增加的COX-2具有抗凋亡作用第一部分实验已经证实了钒能够以NFAT依赖的途径诱导Beas-2B细胞的COX-2表达,本部分实验的目的在于明确诱导表达的COX-2对于Beas-2B细胞具有何种生物学作用,对于细胞的凋亡有何影响。从反向证明的角度,我们利用RNA干扰的技术阻断细胞内COX-2和NFAT3的表达,观察这种情况下细胞受钒化物刺激后的形态以及凋亡情况。首先构建了COX-2和NFAT3的siRNA表达载体siCOX-2和siNFAT3,真核转染Beas-2B细胞,并通过Western blot的方法检测siCOX-2和siNFAT3的干扰效果。在确认干扰效果良好的情况下,镜下观察DN-NFAT转染组,siNFAT3转染组、siCOX-2转染组以及正常对照组细胞在五氧化二钒处理后的存活情况,并通过PI染色流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验结果显示,转染siCOX-2后的细胞Beas-2B/siCOX-2无论有无钒的刺激,均未检测到COX-2蛋白;同样,转染了siNFAT3后的细胞Beas-2B/siNFAT3也未检测到NFAT3蛋白,说明siCOX-2以及siNFAT3能够对Beas-2B细胞中的COX-2和NFAT3起到很好的干扰效果。将DN-NFAT转染组,siNFAT3转染组、siCOX-2转染组细胞用五氧化二钒处理后于光镜下观察,发现细胞死亡较对照组明显增加;利用流式细胞仪进行凋亡检测发现,细胞的凋亡率亦明显高于对照组,提示五氧化二钒诱导表达的COX-2对于Beas-2B具有明显的抗凋亡作用。根据这一结果我们认为,钒本身会造成细胞的损伤,但同时也诱导了细胞的COX-2表达增加,使得细胞出现凋亡抑制效应,逃避了本应该出现的受损细胞程序性死亡,从而转变为具有恶性增殖倾向的细胞,可以在一定程度上解释钒诱发人支气管肺癌的机制。综上所述,我们的研究结果显示,五氧化二钒可以通过NFAT依赖的途径诱导Beas-2B细胞内COX-2的表达;而当阻断了Beas-2B细胞中COX-2的表达或者阻断了细胞中NFAT的活化,细胞在五氧化二钒刺激以后凋亡明显增加。从这些结果我们可以推断,钒致人支气管上皮细胞癌变的机制可能源于其通过NFAT途径诱导产生的COX-2对细胞凋亡的抑制作用。
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