论文摘要
血管性痴呆（vascular dementia,VaD）是由于脑血管疾病和心血管病变的原因导致的获得性、持续性智能障碍综合征，是老年性痴呆中最常见的类型之一,仅次于Alzheimer病。目前VaD的治疗主要针对供血不足、缺血半暗带的脑细胞,通过改善脑循环和脑细胞供氧预防新血栓与再梗死,常用的治疗药物有脑循环改善剂、脑能量代谢激活剂、促进胆碱能系统的药物，从治疗的角度来看，没有突破性进展。神经系统损伤后的恢复是一个多环节、多层面的系统整体调节过程。积极探索促进认知功能恢复的治疗策略,仍是基础医学和临床医学的一个重大课题。天麻为临床治疗中枢神经系统疾病的有效中药，本课题结合血管性痴呆的研究现状，利用行为学、生化和分子生物学方法对天麻的有效成分组1210治疗血管性痴呆的药理作用及其机制进行了深入探讨。主要包括二部分内容：一是采用慢性低灌注性血管性痴呆大鼠模型以及MCAO血管性痴呆大鼠模型对天麻有效成分组1210进行药效学评价。二是从调节血管性痴呆大鼠自由基代谢，海马突触结构蛋白的表达以及重建脑内Glu/GABA学习记忆调节系统稳态的研究思路入手，探讨药物可能的作用环节。1天麻有效成分组1210对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及神经损伤的保护作用1.1天麻有效成分组1210对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响目的：检测1210对MACO血管性痴呆大鼠及慢性低灌注性血管性痴呆大鼠学习记忆功能的影响，对1210治疗血管性痴呆大鼠进行药效学的评价。方法：利用Morris水迷宫对各组大鼠进行学习记忆能力检测，MACO血管性痴呆大鼠造模后24小时开始给药，连续给药30天后进行测试；慢性低灌注性血管性痴呆大鼠造模后24小时开始给药，连续给药60天进行测试。结果：①MACO血管性痴呆大鼠及慢性低灌注性血管性痴呆大鼠空间参考记忆能力下降，搜索隐藏平台的逃避潜伏期和游泳路径明显延长,并在空间探索实验中定位记忆障碍,穿越平台位置的次数减少。同时工作记忆也明显损害，移动平台位置后，动物寻找平台的逃避潜伏期及游泳路径比假手术组明显延长。②1210组大鼠搜索隐匿平台的逃避潜伏期和游泳路径均有不同程度的缩短,准确穿越原平台所在位置的次数比模型组明显增加；移动平台位置后，动物找到平台的时间和游泳路径明显比模型组缩短。结论：MACO血管性痴呆大鼠及慢性低灌注性血管性痴呆大鼠学习记忆功能障碍，1210具有明显改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力的作用1.2天麻有效成分组1210对血管性痴呆大鼠神经病理学改变的影响目的：通过观察MACO血管性痴呆大鼠及慢性低灌注性血管性痴呆大鼠脑组织的病理改变，评价1210对血管性痴呆大鼠神经组织损伤的影响。方法：采用HE染色对两种血管性痴呆模型脑缺血损伤部位进行整体观察，计数海马CA1区和CA3区完整的锥体细胞；采用尼氏体染色结合图像分析技术检测MCAO血管性痴呆大鼠海马锥体细胞尼氏体的变化；以胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞活化及增殖的标志物，应用免疫组织化学方法结合图像分析技术观察血管性痴呆模型海马星形胶质细胞的反应性变化；应用免疫组织化学方法结合图像分析技术检测慢性低灌注性血管性痴呆大鼠内囊部GFAP及MBP的表达，判断慢性低灌注性痴呆大鼠脑白质损害的情况。结果：①MCAO血管性痴呆大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞排列紊乱，部分神经元脱失，尼氏小体含量明显减少，GFAP表达增强。1210明显减轻模型大鼠海马神经元的变性程度，海马CA1区完整锥体细胞数明显增多，海马CA3区和齿状回区GFAP表达明显比模型组降低。②慢性低灌注性血管性痴呆大鼠海马组织形态学异常,部分神经元变性、坏死，完整的锥体细胞数明显减少，海马区和内囊部星形胶质细胞明显增多,GFAP表达上调；内囊部MBP的表达明显减弱。1210对慢性低灌注性大鼠海马组织神经细胞具有保护作用,并能降低海马脑区星形胶质细胞的反应性，提高内囊部MBP的表达。结论：MACO血管性痴呆大鼠及慢性低灌注性血管性痴呆大鼠模型具有明显的缺血性病理改变；1210可以保护海马神经细胞，降低海马脑区星形胶质细胞的反应性，上调慢性低灌注血管性痴呆大鼠白质区MBP的表达。2天麻有效成分组1210防治血管性痴呆的机理研究2.1天麻有效成分组1210对血管性痴呆大鼠海马自由基代谢的影响目的：检测慢性低灌注性血管性痴呆大鼠海马脂质过氧化物的分解产物及抗氧化酶的含量，探讨1210对血管性痴呆大鼠自由基代谢的作用。方法：生化方法检测海马组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、及丙二醛（MDA）的含量。结果：慢性低灌注血管性痴呆大鼠MDA大量生成，抗氧化酶SOD、GSH-PX的含量明显下降。1210（1.6、3.2、6.4 mg/kg）可提高海马组织抗氧化酶SOD活性，降低MDA含量，1210（6.4mg/kg）还能明显提高GSH-PX活性。结论：1210可增加通过增加抗氧化酶活性，降低脂质过氧化物MDA的含量，改善自由基代谢。2.2天麻有效成分组1210对血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经纤维及突触结构蛋白表达的影响目的：对乙酰胆碱合成酶-胆碱乙酰转移酶（ChAT）的阳性表达进行定性、半定量分析,评价药物对胆碱能神经系统的影响；对神经生长相关蛋白（GAP-43）、突触体素（SYN1）、微管相关蛋白2（MAP-2）的表达进行定性、半定量分析，探讨药物对血管性痴呆大鼠海马组织神经突触结构蛋白表达的影响。方法：以多聚甲醛心脏灌注取脑，石蜡包埋切片，进行ChAT、GAP-43、SYN1、MAP-2的免疫组织化学染色，显微镜下观察并进行图像分析。结果：①MACO血管性痴呆大鼠及慢性低灌注血管性痴呆大鼠海马CA1区、CA3区、齿状回区ChAT阳性表达明显降低；1210（1.6 mg/kg）可明显提高MCAO血管性痴呆大鼠海马CA3区的阳性表达；1210（3.2、6.4 mg/kg）治疗组可明显提高慢性低灌注血管性痴呆大鼠CA1、CA3区ChAT的表达。②慢性低灌注血管性痴呆大鼠海马CA1、CA3区SYN1的免疫反应明显减弱, 1210（3.2、6.4 mg/kg）治疗组可上调海马CA1、CA3区SYN的表达。③慢性低灌注血管性痴呆大鼠GAP-43的表达和假手术组相比没有显著性差异，1210各治疗组海马CA1、CA3区、齿状回区GAP-43的表达明显增强。④慢性低灌注血管性痴呆大鼠CA1、CA3区MAP-2免疫阳性树突稀疏,表达面积明显降低，1210组CA1、CA3区MAP-2表达面积明显增强。结论：1210可上调ChAT、SYNI、GAP-43、MAP2蛋白的表达。2.3天麻有效成分组1210对血管性痴呆大鼠海马脑区Glu/GABA学习记忆调节系统的影响目的：系统研究血管性痴呆模型Glu/GABA学习记忆调节系统病理改变的分子机制，探讨天麻有效成分组1210改善学习记忆可能的药理作用及分子靶点。方法：制备慢性低灌注血管性痴呆大鼠模型，分别测定下列指标：ELISA法测定海马组织谷氨酸及γ-氨基丁酸的含量；免疫组织化学方法结合图像分析技术检测海马GABA及Glu能神经元的表达，海马谷氨酸脱羧酶（GAD65）以及NMDA受体功能亚单位NR1，调节亚单位NR2A、NR2B蛋白的表达水平；Real time RT-PCR方法检测神经元谷氨酸转运体（EAAC1）及γ-氨基丁酸转运体（GAT1） mRNA表达的变化，Westernblot方法检测EAAC1及GAT1蛋白的表达变化。结果：①模型大鼠海马Glu含量和假手术组相比没有明显差异，但GABA含量显著降低，GLU和GABA比值明显增高；经1210（1.6、3.2 mg/kg）治疗后，大鼠海马组织GABA含量增高, Glu/GABA的比值降低，提示1210可通过调节Glu/GABA学习记忆系统改善学习记忆能力。②模型大鼠海马CABA能抑制性中间神经元在海马CA1区和齿状回门区选择性缺失，免疫活性降低；Glu能神经元在CA1区免疫活性增强；1210（1.6、3.2 mg/kg）能明显降低海马CA1区Glu免疫反应性，提高GABA的表达强度。③模型大鼠海马组织GAD65阳性表达明显减少，1210（3.2 mg/kg）治疗组海马CA1区、CA3区GAD65的免疫强度明显提高；1210（1.6 mg/kg）治疗组海马CA1区GAD65的表达也明显高于模型组。④模型大鼠海马组织EAAC1mRNA的表达和假手术组相比没有显著性差异，EAAC1蛋白表达水平降低；1210治疗组海马组织EAAC1mRNA和模型组相比没有明显的差异，EAAC1蛋白的表达有不同程度的提高，特别是1210（3.2、6.4 mg/kg）和模型组相比有统计学意义。⑤模型大鼠海马GABA转运体（GAT1）的表达和假手术组相比没有显著性改变，1210治疗组大鼠海马组织GAT1mRNA及GAT1蛋白的表达和模型组组相比也均没有显著性差异。⑥慢性低灌注血管性痴呆大鼠海马NMDA受体功能性亚单位和调节亚单位均有不同程度的降低, NR1在CA1区的表达明显降低；NR2A在CA3区表达明显减弱；而NR2B在CA1区、CA3区及齿状回均明显比假手术组降低。1210（1.6 mg/kg）治疗组大鼠海马CA1区NR1的表达比模型组大鼠明显升高；1210（6.4 mg/kg）大鼠海马齿状回区NR2A免疫反应明显增强；1210（3.2、6.4 mg/kg）大鼠海马各区NR2B的免疫强度均明显增加。结论：天麻有效成分组1210能有效改善血管性痴呆大鼠学习记忆功能的主要作用环节之一为重建Glu和GABA的动态平衡，通过激活CA1区GABA能中间神经元的免疫活性，增强GABA能中间神经元的抑制作用;通过提高GAD65蛋白表达，促进GABA合成；通过上调EAAC1的表达，促进Glu递质重摄取；通过上调NMDA受体功能性亚单位和调节亚单位的表达提高学习记忆功能。结论天麻有效成分组1210可以提高血管性痴呆大鼠学习记忆能力，减轻模型大鼠的神经病理损伤。其可能的作用环节包括：①改善自由基代谢；②上调ChAT的表达，促进胆碱能神经功能的恢复；③有效诱导脑损伤修复过程中突触结构蛋白的表达，促进突触的重塑；④促进脑内Glu/GABA学习记忆调节系统稳态的重建.本研究的创新点以中药有效成分组为研究靶点，从重建脑内Glu/GABA学习记忆调节系统稳态的研究思路入手，在观察药物对兴奋性突触传递影响的同时，研究GABA能神经元以及GABA合成、GABA递质重摄取在血管性痴呆大鼠海马的变化，为临床上进行药物干预和治疗血管性痴呆提供新的分子靶点和药理信息。关于神经元谷氨酸转运体（EAAC1）及γ-氨基丁酸转运体（GAT1）在血管性痴呆模型的表达变化文献未见报道。
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