海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生产、基因克隆和表达的研究

论文摘要

从海洋中分离的近400株酵母中筛选出1株产酸性蛋白酶的海洋酵母菌W6b,并初步确定该酶为细胞结合蛋白酶,命名为SAP6。通过酵母鉴定的常规方法并结合分子生物学方法,对该菌株进行鉴定,鉴定结果为鲁考弗美奇酵母（Metschnikowia reukaufii）。研究了菌株W6b的合成酸性蛋白酶的培养条件,产酶的最适条件为葡萄糖1%、酪蛋白1.5%、酵母粉0.5%、海水配制,培养基初始pH为pH5.0,接种量为7.5×107个细胞/50mL发酵培养基,28℃、140rpm振荡培养,在上述条件下培养48h酸性蛋白酶酶活最高可达到72.5U/mL。粗酶的最适作用温度为40℃,最适作用pH为3.4。利用简并PCR与SMART RACE PCR克隆到了该酸性蛋白酶基因SAP6。基因SAP6的cDNA全长序列为1755 bp,SAP6基因组序列中没有内含子,含开放阅读框（ORF）1527 bp,编码508个氨基酸,蛋白酶前体分子量为53486Da。推导的SAP6氨基酸序列与米曲霉（Aspergillus oryzae）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）的酸性蛋白酶氨基酸序列相似度分别为18.11%、20.52%和28.6%。通过分子生物学软件分析,基因SAP6有一个含16个氨基酸残基的信号肽序列,一个真核Asartyl（acid）蛋白酶家族（EC 3.4.23）序列特征的保守区,两个真核和病毒（Eukaryotic and viral）天冬氨酸活性位点,6个N-糖基化位点。Kyte和Doolittle疏水性分析显示SAP6与酿酒酵母细胞壁锚定的酸性蛋白酶具有高度相似的GPI-锚定结构。将cDNASAP6克隆到大肠杆菌pET-24a（+）表达载体中,构建了表达载体pET-24a（+）SAP6,在大肠杆菌BL21（DE3）中利用IPTG进行诱导表达,重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为54kDa,重组酸性蛋白酶粗酶液与SAP6一样具有牛奶凝固特性和水解蛋白形成透明圈的能力,证明克隆到的基因SAP6确实为酸性蛋白酶基因。这是关于美奇酵母属酸性蛋白酶基因克隆和表达的首次研究报导。通过Ni柱亲和层析法对重组酸性蛋白酶进行了纯化,纯化的重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为54kDa。重组酸性蛋白酶的最适作用温度是40℃,在40℃以下重组酶的热稳定性较好,40℃以上酶活迅速下降;最适pH为3.4,在pH 2.6～5.0范围内有较好的稳定性。Mn2+对重组酶的活性有轻度的激活作用,Cu2+对重组酶的活性有较大的抑制作用,与已报导的酵母菌和霉菌酸性蛋白酶差异明显,表明SAP6可能为新型酸性蛋白酶。重组酶明显受Pepstatin的抑制,EDTA基本对重组酶活性无抑制作用;PMSF和碘乙酸对重组酶活力基本无影响,SDS可部分抑制酶的活力,说明重组酶为天冬氨酸蛋白酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 酸性蛋白酶
• 1.1 酸性蛋白酶的来源
• 1.2 酸性蛋白酶的酶学性质
• 1.2.1 酸性蛋白酶的最适作用pH及pH稳定性
• 1.2.2 酸性蛋白酶的最适作用温度及温度适应性
• 1.2.3 酸性蛋白酶的抑制剂
• 1.2.4 金属离子对酸性蛋白酶的影晌
• 1.3 产酸性蛋白酶的微生物
• 1.4 酸性蛋白酶的分类
• 1.5 酸性蛋白酶的应用
• 1.5.1 酸性蛋白酶在皮革工业中的应用
• 1.5.2 酸性蛋白酶在食品工业中的应用
• 1.5.3 酸性蛋白酶在畜牧业中的应用
• 1.5.4 酸性蛋白酶在医疗方面的应用
• 1.6 国内外酸性蛋白酶的研究进展
• 1.6.1 酸性蛋白酶菌种选育
• 1.6.2 酸性蛋白酶分子生物学方面的研究进展
• 2 GPI锚定蛋白简介
• 2.1 GPI锚定蛋白的结构特点
• 2.2 酵母菌中GPI锚的合成及相关过程酶的基因
• 2.3 GPI锚的功能
• 2.3.1 GPI的膜整合特性
• 2.3.2 GPI与细胞信号的传递
• 2.3.3 GPI与锚定蛋白之间的连接
• 2.4 基于GPI锚定原理的表面展示系统
• 3 海洋酵母菌资源及应用简介
• 3.1 海洋酵母的定义
• 3.2 海洋酵母种类与分布
• 3.2.1 河口和红树林地区
• 3.2.2 大洋水体和深海沉积物
• 3.3 海洋酵母研究进展及意义
• 3.3.1 海洋酵母合成丰富的活性物质
• 3.3.2 海洋酵母菌降解环境污染物
• 3.3.3 海洋酵母菌适应极端环境
• 4 论文的研究目的与意义
• 第二章 产酸性蛋白酶海洋酵母菌的筛选及鉴定
• 1 前言
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品来源
• 2.2.2 海洋酵母的分离
• 2.2.3 产酸性蛋白酶海洋酵母菌的初筛
• 2.2.4 产酸性蛋白酶菌株的复筛
• 2.2.5 考马斯亮蓝法测定总蛋白的含量
• 2.2.6 酸性蛋白酶活测定方法
• 2.2.7 产酸性蛋白酶海洋酵母的菌种鉴定
• 3 实验结果
• 3.1 菌株初筛结果
• 3.2 菌株复筛结果
• 3.3 菌株鉴定结果
• 3.3.1 酵母菌常规形态特征和生理生化反应实验结果
• 3.3.2 酵母菌W6b分子生物学鉴定实验结果
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第三章 W6b产酸性蛋白酶的培养条件优化
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种来源
• 2.2 培养基
• 2.3 培养条件
• 2.4 细胞生长量的测定
• 2.5 酸性蛋白酶活力的测定
• 2.6 酶的最适反应温度
• 2.7 酶的最适作用pH
• 3 结果与讨论
• 3.1 酸性蛋白酶粗酶的最适作用温度
• 3.2 酸性蛋白酶粗酶的最适作用pH
• 3.3 培养条件的优化
• 3.3.1 不同培养起始pH对产酶和细胞生长的影响
• 3.3.2 不同培养温度对产酶和细胞生长的影响
• 3.3.3 不同摇床转速对W6b产酶和细胞生长的影响
• 3.3.4 接种量对W6b产酸性蛋白酶和细胞生长的影响
• 3.4 培养基组分的优化
• 3.4.1 不同碳源对产酶的影响
• 3.4.2 不同氮源对产酶和细胞生长的影响
• 3.4.3 不同浓度的葡萄糖对产酶的影响
• 3.4.4 不同浓度的酪蛋白对产酶的影响
• 3.4.5 不同浓度的酵母提取物对W6b产酶的影响
• 3.5 W6b菌在优化的培养条件下的生长和产酶过程曲线
• 4 本章小结
• 第四章 酸性蛋白酶的基因克隆
• 1 前言
• 第一节 简并PCR扩增W6b酸性蛋白酶的保守序列
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 缓冲液及抗生素
• 2 方法
• 2.1 海洋酵母W6b基因组DNA的提取
• 2.2 简并引物的设计
• 2.3 简并PCR扩增
• 2.4 PCR结果观察
• 2.5 PCR产物的回收
• 2.6 PCR产物与T载体连接
• 2制备大肠杆菌感受态的制备'>2.7 CaCl₂制备大肠杆菌感受态的制备
• 2.8 大肠杆菌转化
• 2.9 阳性克隆的筛选
• 2.10 质粒提取
• 2.11 阳性克隆质粒的酶切验证
• 2.12 目的片断测序和比对
• 3 结果和讨论
• 3.1 简并PCR引物的设计
• 3.2 简并PCR克隆酸性蛋酶SAP6部分基因
• 3.2.1 海洋酵母M.reukaufii W6b基因组DNA的提取
• 3.2.2 简并引物PCR
• 3.2.3 简并引物PCR结果
• 第二节 SMART RACE PCR扩增酸性蛋白酶全长序列
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 海洋酵母M.reukaufii W6b RNA的提取
• 2.2 引物设计
• 2.3 3'-cDNA和5'-cDNA第一链的合成
• 2.4 3'-RACE及5'-RACE获得全长cDNA
• 2.5 酸性蛋白酶基因SAP6全长cDNA的获得
• 2.6 酸性蛋白酶基因SAP6基因组DNA全长序列的获得
• 2.7 PCR结果观察
• 2.8 PCR产物回收、连接、测序
• 2.9 酸性蛋白酶基因SAP6生物信息学分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 海洋酵母M.reukaufii W6b RNA的提取和第一链cDNA的合成
• 3.2 引物设计
• 3.3 3'-RACE及5'-RACE PCR及全长cDNA的克隆
• 3.4 酸性蛋白酶基因cDNA序列和推导的氨基酸序列
• 3.5 酸性蛋白酶生物信息学分析
• 3.5.1 酸性蛋白酶基因序列在NCBI的比对结果
• 3.5.2 酸性蛋白酶氨基酸序列分析
• 3.5.3 酸性蛋白酶SAP6氨基酸序列与其它酸性蛋白酶同源性比对
• 4 本章小结
• 第五章 酸性蛋白酶基因cDNASAP6在大肠杆菌中的表达、纯化和重组酶性质的研究
• 第一节 酸性蛋白酶基因cDNASAP6在大肠杆菌中的诱导表达
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 提取质粒pMD19T-cDNASAP6
• 2.2.2 E.coli BL21（DE3）感受态的制备
• 2.2.3 表达载体pET-24a（+）SAP6的构建
• 2.2.4 pET-24a（+）SAP6在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.5 不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测
• 2.2.6 Immunoblotting（Western blotting）鉴定
• 2.2.7 重组酸性蛋白酶酶活测定
• 2.2.8 重组酸性蛋白酶的脱脂牛奶凝固试验
• 3 结果与讨论
• 3.1 pET-24a（+）SAP6表达载体的构建
• 3.2 pET-24a（+）SAP6在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.3 重组酸性蛋白酶酶活测定和水解能力分析
• 第二节 重组酸性蛋白酶的纯化和酶学性质研究
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 pET-24a（+）SAP6在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.2 重组酸性蛋白酶粗酶液的制备
• 2.2.3 重组酸性蛋白酶的纯化
• 2.2.4 纯化的重组蛋白（rSAP6）SDS-PAGE和Western blotting鉴定
• 2.2.5 酶活力测定
• 2.2.6 蛋白酶含量测定
• 2.2.7 纯化的重组酸性蛋白酶（rSAP6）的酶学性质
• 3 结果与讨论
• 3.1 重组酸性蛋白酶rSAP6-his的分离与纯化
• 3.2 重组酸性蛋白酶rSAP6-his的酶学性质
• 3.3.1 温度对酶活性及酶热稳定性的影响
• 3.3.2 pH对酶活性及酶稳定性的影响
• 3.3.3 金属离子对酶活力的影响
• 3.3.4 酶抑制剂对重组酶活力的影响
• 4 本章小结
• 总结与创新点
• 参考文献
• 附录
• 在学期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢