论文摘要
研究背景：肝脏是机体最重要的生命器官之一,其具有复杂的结构和多种生理功能,其主要生理功能为氧化解毒,储存糖原,代谢胆固醇,合成分泌型蛋白和某些激素以及分泌胆汁等[1]。肝功能衰竭（Acute liver failure, ALF）是一种严重的临床综合症,其病死率达到60%-90%[2]。目前治疗肝衰竭方法有：1.内科治疗。2.人工肝治疗。3.肝脏移植治疗[3]。迄今为止,肝衰竭最有效的治疗方法就是原位的肝移植[4]（Liver transplantation, LT）。但由于供体缺乏,患者病情危重,没有充分的时间来等待合适肝源,故病死率高,预后极差。以体外培养肝细胞为基础的生物人工肝等治疗手段的出现有望像人工肾一样作为肝功能肝脏移植手术的过渡治疗,维持患者的生命,使其能安全过渡到肝脏移植手术[5]。生物反应器是整个生物人工肝的核心部分,其性能将直接关系到生物人工肝的支持效果。通常来说,一个理想的生物反应器应该满足以下的几点：1、提供一个良好的环境给肝细胞生长以及代谢；2、使得血液（或者血浆）和肝细胞之间有充分的双向物质及气体交换；3、防止肝脏细胞受到自身免疫系统的损伤以保证血液（或者血浆）及肝细胞之间的高通量的物质交换；4、能够培养足够的细胞符合医疗的需要；5、反应器中的无效空间应该达到最小化[6,7]。如何设计最佳的新型生物反应器,实现体外肝细胞的大规模培养及其培养过程中肝细胞功能与活率的有效维持,同时能够满足临床应用的需要,仍是目前生物人工肝发展的核心问题。经过20余年发展,目前国内外在生物反应器的结构上,至今为止可以分为以下5大类：1、单层培养/平板式的生物反应器；2、中空纤维型的生物反应器；3、灌流床式/支架型生物反应器；4、包被悬浮生物反应器；5、其它的综合型反应器[8-12]。但是,现有的生物反应器仍未达到理想的效果,目前生物反应器存在的四个主要问题：1、无法模仿肝内的环境,维持肝细胞的3D结构。2、无法充分进行细胞的氧供及营养供给。3、无法在体外进行大规模细胞培养（理想的人工肝细胞量为正常肝脏细胞量的1/5-1/10,即1-2×1010[13]）,同时维持细胞的功能[14-16]。RCCS系统是由美国国家航空与宇宙航行局（national aeronautics and space administration, NASA）研制的,目前主要应用到组织及细胞培养领域,它是一种通过调整充满培养液的容器的旋转速度来抵消其内细胞的沉降率,从而实现模拟三维微重力环境的新型生物反应器。在这一体系中,细胞处于失重状态,使细胞更好更稳固底贴壁于微载体上,促进细胞聚集、三维生长。同时其还具有低剪切力,低湍流,能充分的氧气及营养物质交换等特点[17,18]。这种悬浮培养技术为多种细胞和组织块的生长和代谢提供良好的培养环境,可以进行高密度的组织培养,并保持所培养细胞的组织分化特异性。目前国内外研究者广泛的应用到脂肪干细胞、软骨细胞、成骨细胞及肝细胞、干细胞、神经细胞、淋巴细胞等细胞三维培养研究中[19]。张钰鹏[20]、江青艳[21]等利用大鼠原代肝细胞,采用旋转细胞培养系统进行模拟微重力培养。模拟微重力培养中肝细胞贴附微载体并出现三维结构,发展为独特的肝细胞、微载体聚球体。姚新宇[22]对肝干细胞模拟微重力下三维培养。证明模拟微重力环境能促进肝干细胞呈三维立体结构生长,有利于细胞快速增殖并维持细胞活性和表型。为进一步深入研究微重力生物反应器作为一种新型生物人工肝生物反应器的可行性,本课题组引进了美国航空航天局（National Aeronautics and SpaceAdministration简称NASA）设计的500ml体积的旋转灌注微重力生物反应器（Rotary Culture MWTM,简称RCMW）[23],但经过反复的实验研究表明[24,25],美国航空航天局生产的RCMW微重力生物反应器在设计上存在严重的缺陷：1.水平方向的力无法平衡；2.物质交换受到巨大限制,效率低下；3.系统中没有气体有效供应和交换,完全不能满足生物人工肝生物反应器的需求。本实验前期[25]通过对美国NASA公司RCMW旋转灌注微重力生物反应器内芯及循环模式的优化改进的基础上,加设了外置氧合器,成功研制了第一代新型双向旋转灌注微重力生物反应器系统,实现了有效的营养物质、氧气及代谢产物双向物质传输,最大可能减小了反应器内的培养死腔,为肝细胞提供低剪切力模拟微重力的良好生长和代谢环境,有效促进并维持体外培养人肝C3A细胞的功能；并可进一步扩大培养规模,满足临床治疗需求,能基本满足理想生物人工肝生物反应器的各项要求,为新型生物人工肝生物反应器的研制提供了一个新的方向。但其还存在不足之处,主要表现为以下4个问题：1.系统水平方向压力不平衡,由于各个泵精密度及管道变形性差异,造成反应器进出液体有差异,导致反应罐内压力不平衡,罐子内液体进入液体过多,出来液体过少,罐子内压力过大,反应器盖子被顶开,难以运行。2.循环模式的问题,使用新的流向控制系统后,由于只有一个泵,因此泵的位置非常的关键。如果将泵放前面,由于反应罐内阻力的作用,导致流出反应罐液体减少,少于进反应罐液体,液体进出不平衡,导致系统反应罐内压力过大,反应罐停止转动,系统停止运行。3.系统氧合器F6透析柱产生气体太多,管路气体影响系统运转,每隔3小时要排气一次,操作过于麻烦,同时反复打开孵箱排气,不利于反应器的内环境稳定。4.管路设计太复杂,不方便操作。气泡过滤器、双向管路太多、太长,太复杂,难以进行操作。为此,本课题拟通过对RCMW生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,设计出第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,为新一代生物人工肝生物反应器的发展开辟一个新的方向与思路。研究目的：通过对第一代双向旋转灌注微重力生物反应器存在的问题进行优化改进,设计出第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器。研究方法：在第一代双向旋转灌注微重力生物反应器的基础上,通过动力系统及供气系统优化构建,形成由细胞培养罐、培养液池、动力控制系统（蠕动泵、换向槽）、供气系统组成的第二代新型双向旋转灌注微重力生物反应器系统。第一代双向旋转灌注微重力生物反应器、第二代双向旋转灌注微重力生物反应器中,持续微载体三维培养7天,并通过MTT染色、细胞计数、培养上清中ALT、AST、白蛋白、尿素浓度等指标测定,比较两组肝细胞活力、数量和功能差异。统计方法：计量资料以均数±标准差（X±s）表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。数据采用两组间均数比较采用t检验分析,显著性检验水平a=0.05.研究结果：美国NASA公司商品化RCMW微重力生物反应器存在微载体/细胞堵塞,双向物质交换效率低下及出现培养死腔等缺点。而改进后的第一代双向旋转灌注微重力生物反应器中双向物质交换效率明显提高,但其存在四大问题：1.系统压力不平衡,由于各个泵精密度差异,形成水平方向压力不平衡。2.泵位置问题。3.系统氧合器F6透析柱产生气体太多,管路气体影响系统运转,每隔3小时要排气一次。4.管路设计太复杂,不方便操作。重新改进的第二代双向旋转灌注微重力生物反应器,充分解决了这些问题。倒置显微镜下形态学及MTT细胞活力染色结果可见,第二代双向旋转灌注微重力生物反应器组人肝C3A细胞（C3A）的数量与活力均明显优于RCMW生物反应器组。电镜结果显示：第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组中,载体上细胞较少,而第二代双向反应器培养组中,载体上的肝细胞相互紧密连接,组成的肝脏样组织。生长曲线结果显示,两组人肝C3A细胞密度均为先升高后逐渐下降,分别于第5天达肝细胞密度峰值。且第二代双向旋转灌注微重力生物反应器组人肝C3A细胞密度于第1至7天均明显高于第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组,差异均有统计学意义（P<0.05）。肝细胞功能结果显示,两组白蛋白、尿素合成功能均为先升高后逐渐下降,分别于第5天达峰值,且第二代双向旋转灌注微重力生物反应器组上清白蛋白、尿素浓度于第1至7天均明显高于第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组组,差异均有统计学意义（P<0.01）。此外,第二代双向旋转灌注微重力生物反应器中ALT、AST于第1至7天均明显低于第一代双向旋转灌注微重力生物反应器组,差异均有统计学意义（P<0.05）。研究结论：本研究通过对RCMW生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,成功设计出了第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,可有效解决RCMW生物反应器中存在的各种设计缺点,大大提高体外培养人肝C3A细胞的密度、活力及功能,有望成为新一代生物人工肝生物反应器。研究结论：本研究通过对第一代双向旋转灌注微重力生物反应器设计上存在的问题进行优化改进,成功设计出了第二代新型双向旋转灌注式微重力生物反应器,可有效解决RCMW生物反应器中存在的各种设计缺点,大大提高体外培养人肝细胞的密度、活率及功能,有望成为新一代生物人工肝生物反应器。
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标签：生物人工肝论文; 微重力循环灌注培养论文;