乙型脑炎病毒反向遗传学系统的建立及应用

论文摘要

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）是一种严重的急性神经系统传染病,主要通过携带乙型脑炎病毒的蚊媒叮咬传播,病死率高,后遗症严重。该病主要流行于东南亚地区,但是目前有扩散的趋势,对人类健康和公共卫生构成严重威胁。我国研制的乙型脑炎病毒减毒活疫苗至今已接种3亿人份,其安全性及有效性俱佳。用于乙型脑炎减毒活疫苗生产的毒株是SA14-14-2,它是由亲本野毒株SA14经过在细胞和动物中不断传代和多轮蚀斑纯化获得的疫苗株。与野毒株SA14相比,疫苗株SA14-14-2的毒力明显减弱,对鼠和猴等动物的致病性几乎完全丧失,但是其减毒的分子机制并不明确。在本研究中,我们首先利用分子生物学技术构建乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的亚基因组复制子,并利用该复制子初步观察乙型脑炎病毒E蛋白羧基末端氨基酸序列对于复制子复制的影响;在疫苗株复制子的基础上,我们构建并拯救含有乙型脑炎病毒强毒株SA14的E基因的嵌合病毒,观察该嵌合病毒的生物学特征,为乙型脑炎病毒疫苗株的减毒机制研究奠定基础。一、乙型脑炎病毒亚基因组复制子的构建我们首先利用分子生物学技术构建获得了乙型脑炎病毒复制子,将复制子经体外转录后转染BHK21细胞,用间接免疫荧光和RT-PCR的方法对复制子进行了鉴定,发现其可以在转染细胞内进行自身RNA的复制和蛋白表达。为了进一步检测复制子的复制能力,我们构建了含有GFP报告基因的复制子,转染细胞后发现其可以在细胞内正常表达GFP。同时,为了探讨乙型脑炎病毒E蛋白羧基端氨基酸长度对病毒复制的影响,我们分别构建了一系列保留E蛋白羧基端不同数目氨基酸残基的报告基因复制子。将获得的复制子质粒线性化并体外转录后转染BHK-21细胞,通过检测报告基因的活性来观察复制子复制能力和表达外源蛋白的能力。结果显示,所构建的复制子可自主复制和表达外源蛋白,在BHK-21细胞中可持续表达绿色荧光蛋白达10天以上,并且细胞无明显病变。但是不同的复制子,在不同时间点转染细胞中的绿色荧光强度不同,这表明复制子的复制能力有差异,因此我们认为,E蛋白羧基端保留的氨基酸数目对复制子的复制具有一定的影响。总之,我们在本部分中成功构建了乙型脑炎病毒疫苗株的亚基因组复制子,并且证实其可以进行自主复制并且持续表达外源蛋白。二、乙型脑炎嵌合体病毒的构建及其生物学特征嵌合病毒是由结构功能相似的同源或者异源病毒相互替换部分结构基因而3获得的病毒,主要应用于病毒致病和减毒机理及新型疫苗的研究。在本研究中,我们在已经构建好缺失了prM/E基因的SA14-14-2亚基因组复制子的基础上,将乙型脑炎强毒株SA14的prM/E结构基因嵌合到复制子的骨架上,通过反向遗传学技术构建并获得了嵌合全长感染性克隆,并对该乙型脑炎嵌合病毒的生物学特征进行了观察。首先,我们对嵌合病毒在不同细胞系中的生长特性进行测定,结果发现其与亲本病毒株相比无显著差异。其次,通过对嵌合病毒的蚀斑特征及在动物体内的神经毒力和神经侵袭力进行测定,结果显示嵌合病毒的蚀斑大小介于两亲本株之间,其神经毒力和神经侵袭力与强毒株较为接近。最后,我们通过比较嵌合病毒及其亲本病毒株在调控I型干扰素信号通路方面的差异来探讨乙脑病毒疫苗株的减毒机制。结果发现,嵌合病毒与强毒株一样可以抑制STAT1分子的磷酸化及STAT1分子的核转运进程,进而抑制I型干扰素诱导的重要信号转导通路—JAK-STAT通路。随后我们将嵌合病毒及其亲本病毒株通过腹腔途径接种于正常129小鼠和I型干扰素基因敲除的A129小鼠,结果发现:在正常129小鼠中嵌合病毒与SA14一样可以使感染的小鼠死亡,而疫苗株不致病;在敲除了IFN-α/β基因的A129小鼠中,嵌合病毒,强毒株和疫苗株均可以使小鼠在感染后3天内死亡。这说明,在正常129小鼠中,疫苗株由于无法抑制I型干扰素通路因而被免疫系统快速清除,而嵌合病毒和强毒株一样可以抑制I型干扰素通路,无法快速被清除。当敲除I型干扰素基因后,疫苗株则与嵌合病毒及强毒株一样可以不受I型干扰素的影响,在小鼠中能正常复制并且使小鼠发病死亡。由于嵌合病毒与疫苗株仅在E蛋白上具有氨基酸差异,因此我们推断,乙型脑炎强毒株与疫苗株在E蛋白上的差异在一定程度上影响病毒对于I型干扰素通路的拮抗作用,而这也有可能是疫苗株的减毒机制之一。综上,本研究首先利用反向遗传学技术构建了可以自主复制和表达外源蛋白的乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的复制子,并在此基础上成功拯救了乙型脑炎病毒的同源嵌合病毒,通过对嵌合病毒及其亲本株病毒生物学特征的鉴定和比较,我们发现乙型脑炎病毒包膜E蛋白很大程度上决定病毒的毒力、侵袭力及对I型干扰素信号通路的拮抗能力。乙型脑炎病毒反向遗传学系统的建立为乙型脑炎病毒的基因组结构功能研究以及新型疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 乙型脑炎病毒亚基因组复制子的构建
• 1. 材料与方法
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第二部分 乙型脑炎嵌合病毒的构建及其生物学特征
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 总结
• 参考文献
• 硕士期间撰写的论著
• 综述：昆津病毒复制子——一种新型病毒载体
• 论文：Cross protection against lethal West Nile virus challenge in mice immunized with recombinant E protein domain III of Japanese encephalitis virus
• 个人简历
• 致谢