基于DSAIFF方法的玉米mio16∷Mu基因的克隆

论文摘要

玉米基因组中存在大量的转座子、反转座子序列。利用各种活化的玉米转座子可以有效地构建插入突变体库。玉米中Mutator（Mu）转座子具有诱导高频率正向插入突变的特点,已成为构建玉米突变体并开展分子生物学研究的有效工具。本研究以杨文鹏博士提供的Mu插入突变体库中筛选到的不透明（opaque）胚乳突变体{命名为Mu-inserted opaque16 （mio16）}为试材,以籽粒不透明胚乳为选择表型,通过回交转育将突变基因mio16导入到野生型透明胚乳自交系QCL2179背景中,以QCL2179为轮回亲本构建BC3F2：3家系；采用插入位点侧翼序列的双向选择性扩增（DSAIFF）方法获得Mu插入侧翼序列（Mu Flanking Fragment:MFF）;对BC3F2：3家系进行靶基因序列和表型的共分离验证；基于公布的玉米基因组序列信息,利用生物信息学研究方法完成mio16的电子定位；根据基因序列设计引物,检测mio16的RNA表达水平；使用反转录聚合酶链式反应引物扫描技术扩增Mio16全长cDNA,分析Mu插入位点。获得如下研究结果：1.采用DSAIFF方法得到插入位点的两侧翼序列：MseI-MFF和MspI-MFF。2.序列分析表明：MseI-MFF和MspI-MFF具有相同的9-bp靶位点正向重复,证明了Msel-MFF和MspI-MFF为同一靶基因的两侧边序。3.共分离检测研究结果表明：靶基因mio16与不透明胚乳籽粒表型相关。4.电子定位结果表明：Mio16位于玉米4.09 bin。5.RT-PCR引物扫描的技术扩增得到的Mio16的全长cDNA约3.3 kb,预测其编码的蛋白长为850 aa。Mio16由11个外显子和10个内含子组成,Mu因子插入距转录起始位点下游35 bp处的5`-非转录区域（UTR）中。6.RT-PCR检测mio16的RNA表达水平结果显示：Mu因子的插入改变了靶基因的表达方式,并且mio16可能是多拷贝。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 玉米转座子的发现
• 1.2 Mu因子
• 1.2.1 Mu因子的发现
• 1.2.2 Mu因子家族
• 1.2.3 Mu因子的转座活性
• 1.2.4 Mu因子的插入位点
• 1.3 Mu因子的遗传应用-Mu标签法（Mu-tagging）
• 1.4 分离Mu侧翼序列（Mu Flanking Fragment:MFF）
• 1.5 opaque突变研究
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 突变体家系的选育
• 2.2 DNA的制备
• 2.3 DSAIFF分离Mu侧翼序列（MFF）
• 2.4 MFFs富集、回收和测序
• 2.5 共分离分析
• 2.6 生物信息学分析
• 2.7 总RNA的提取
• 2.8 反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction:RT-PCR）
• 2.9 全长cDNA的分离
• 2.10 引物设计、测序和试剂
• 3 结果
• 3.1 DSAIFF方法的探索
• 3.2 用限制性内切酶MspⅠ,MseⅠ分离得到MFFs
• 3.3 共分离分析
• 3.4 mio16的电子定位
• 3.5 mio16 mRNA表达
• 3.6 基因结构与Mu因子插入位点
• 4 讨论
• 4.1 关于DSAIFF
• 4.2 不同的9-bp TSDs
• 4.3 MFFs与表型的关系
• 4.4 Mio16转录水平的异常表达
• 4.5 下步工作计划
• 参考文献
• 附录
• 附录1 玉米叶片小量DNA提取
• 附录2 QIAquick PCR Purification Kit Protocol
• 附录3 DSAIFF PCR反应体系和扩增条件
• 附录4 PAGE电泳分子试剂及其步骤
• 附录5 Total RNA isolation（Invitrogen）
• 附录6 ReverTra Ace-α-合成cDNA第一链（TOYOBO）
• 致谢