微波制备相对低分子及寡聚透明质酸及其生物活性研究

论文摘要

透明质酸（hyaluronic acid,HA）是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-（1→4）糖苷键和β-（1→3）糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖,其重均分子量（?）w一般为10万～1000万Da,分子中两种单糖的摩尔比为1:1。HA常用的制备方法有动物组织提取法和细菌发酵法。目前,人们对HA的结构、性质和生理功能都进行了较为充分的研究,其在临床上的应用也日益广泛。研究发现,HA的部分生物活性与其Mr的大小有密切关系,高Mr HA与低Mr HA（low molecular weight hyaluronic acid,LMWHA）具有不同的生物活性,甚至具有相反的生物活性。LMWHA逐渐成为国内外研究的热点。本课题重点研究了LMWHA的微波降解制备工艺、理化性质、结构分析及其促血管生成活性。1 MW-HA的制备工艺研究本文研究了用微波降解制备LMWHA的方法,对方法中主要的降解条件进行了优选,确定了微波降解的最佳条件为105℃、pH3。2 MW-HA的性质与结构研究运用紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、13C-NMR核磁共振波谱分别对微波降解HA（MW-HA）、酸降解HA（CH-HA）和酶降解HA（ED-HA）主要结构与未降解的HA进行了比较。3种不同降解方法得到的LMWHA与HA相比,其谱图基本一致,说明经降解后的HA样品结构只是由长链变为短链,而两种单糖的组成和结构均未发生较大变化。3 MW-HA的促血管生成活性研究探讨了MW-HA对人脐静脉血管内皮细胞（ECV304）增殖的影响及其促血管生成作用。采用噻唑蓝（MTT）法观察MW-HA对ECV304的增殖作用;并研究了MW-HA在鸡胚绒毛尿囊膜模型（CAM）中的促血管生成作用。证明了MW-HA在150～600μg/mL的浓度范围内可以促进EVC304的增殖。促血管生成实验研究结果表明,样品组和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）组与蒸馏水空白对照组相比,血管生成数明显增加（P＜0.05）,随着LMWHA浓度升高,主血管变得粗壮,血管分支增多,血管密度明显增大,提示LMWHA有促进CAM血管生成作用且呈剂量依赖性。ED-HA、MW-HA均具有促进CAM血管生成活性,两者没有明显差异,但从新生血管数目上看,ED-HA的作用较强。MW-HA与CH-HA从新生血管数目上看,微波降解制备的LMWHA的作用较强。4本课题的主要成果:（1）对微波降解制备LMWHA的方法进行了研究,并进行了降解条件优化,获得了制备MW-HA的最佳反应条件为105℃、pH3;（2）制备了分子量在10 kDa以下的MW-HA,部分理化指标结果表明与降解前基本无差异;设计了一套微波降解的工艺,实验证明用微波降解制备10 kDa以上的产品,具有快速、结构破坏小等优点。（3）对MW-HA的紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、13C-NMR核磁共振波谱进行了分析,比较了HA降解前后结构变化情况;并比较了相同分子量MW-HA、ED-HA、CH-HA及未降解HA的谱图,证实微波降解在降解4h,分子量小于8 kDa时基本无结构破坏,因微波本身加热均匀、快速等优点,微波不失为一种制备LMWHA的好方法。（4）采用CAM血管生成模型对MW-HA、ED-HA、CH-HA的促血管生成活性进行了研究,结果表明MW-HA、ED-HA、CH-HA均有促血管生成活性且呈剂量依赖性,三者的活性没有统计学意义上的差异。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1 HA的分布、结构、性质与生理功能
• 1.1 HA的分布
• 1.2 HA的结构
• 1.3 HA的性质
• 1.3.1 一般性质
• 1.3.2 流变学特性
• 1.3.3 黏弹性
• 1.3.4 交联反应
• 1.3.5 成盐反应
• 1.4 HA生理功能
• 1.4.1 构成多种基质
• 1.4.2 保水、渗透压调节和分子排阻作用
• 1.4.3 润滑和保湿作用
• 1.4.4 对细胞的作用
• 2 微波化学的研究进展
• 2.1 微波加速有机反应的机理
• 2.2 微波对多糖的降解应用
• 3 低分子量透明质酸研究概况
• 3.1 LMWHA的制备
• 3.1.1 化学降解
• 3.1.2 物理降解
• 3.1.3 HAas降解
• 3.2 LMWHA及寡聚HA生物活性的研究
• 3.2.1 促进骨生成作用
• 3.2.2 调节类前列腺素合成
• 3.2.3 细胞免疫活化作用
• 3.2.4 促血管生成作用
• 4 微波制备LMWHA及寡聚HA研究的现状及存在的问题
• 5 本课题主要研究内容
• 第二章 微波制备低分子量及寡聚透明质酸
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 微波反应器制备LMWHA
• 2.1.1 微波降解HA的实验装置
• 2.1.2 影响条件的确立
• 2.2 酸降解制备LMWHA
• 2.2.1 酸降解制备LMWHA的实验装置
• 2.2.2 酸降解制备LMWHA的实验
• 2.3 HAas降解制备LMWHA
• 3 理化性质确定
• 3.1 溶液颜色及澄清度变化
• 3.2 Mr测定（多角度激光光散射仪与GPC联用法）
• 3.2.1 色谱条件
• 3.2.2 样品溶液的制备
• 3.2.3 样品分子量测定
• 3.3 紫外光谱扫描
• 3.4 红外光谱扫描
• 4 结果
• 4.1 LMWHA及O-HA的制备
• 4.1.1 微波法制备LMWHA
• 4.1.2 酸降解制备LMWHA
• 4.1.3 HAas降解制备LMWHA
• 4.2 理化性质
• 4.2.1 溶液颜色及澄清度变化
• 4.2.2 紫外图谱
• 4.2.3 红外图谱
• 5 讨论
• 第三章 大量制备LMWHA及寡聚的试验及产品的理化性质研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 大量制备LMWHA及寡聚HA实验研究
• 2.1.1 实验装置
• 2.1.2 微波降解
• 2.1.3 取样
• 2.2 对照试验
• 2.3 LMWHA及寡聚HA理化性质的测定
• 2.3.1 Mr量测定
• 2.3.2 运动黏度的测定
• 2.3.3 糖醛酸含量测定
• 2.3.4 紫外光谱扫描
• 2.3.5 红外光谱扫描
• 2.3.6 核磁共振图谱测定
• 2.4 酒精沉淀
• 3 结果
• 3.1 Mr及其分布
• 3.1.1 微波法制备的LMWHA的Mr及其分布
• 3.1.2 85℃水浴制备的LMWHA的Mr及其分布
• 3.2 运动黏度的变化趋势
• 3.2.1 微波法制备的LMWHA运动黏度的变化趋势
• 3.2.2 85℃酸降解制备的LMWHA运动黏度的变化趋势
• 3.3 糖醛酸含量变化
• 3.4 紫外光谱
• 3.5 红外光谱
• 3.6 核磁共振图谱测定
• 3.7 酒精沉淀倍数对LMWHA性质的影响
• 4 讨论
• 第四章 低分子量及寡聚透明质酸促血管生成活性研究
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 细胞培养及冻存试剂的配制方法
• 2 方法
• 2.1 LMWHA及寡聚HA促进ECV304细胞增殖影响
• 2.1.1 内皮细胞的复苏
• 2.1.2 内皮细胞的传代
• 2.1.3 MTT法检测内皮细胞增殖
• 2.2 CAM模型试验
• 2.2.1 CAM模型的建立
• 2.2.2 LMWHA对CAM血管生成的影响试验
• 3 结果
• 3.1 LMWHA对内皮细胞的促进作用
• 3.2 LMWHA对CAM血管生成的影响
• 4 讨论
• 附图
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表