论文摘要
建立小肠黏膜上皮细胞系,一方面可以从体外直接研究小肠上皮细胞的生物学特征、细胞增殖和分化的调控,以及小肠上皮细胞的营养和代谢,并克服饲养动物所耗用的巨大代价。另一方面,不同类群的肠细胞之间广泛地相互作用使得试验研究极其困难,而体外细胞培养为研究肠上皮细胞消化吸收营养物质和肠屏障损伤提供了简单、快速和准确的手段,并为研究营养素对肠上皮细胞的作用提供了理想的体外模型。本试验使用了多种酶消化方法分离新生山羊小肠上皮细胞,结果发现使用200 U/mL胶原酶Ⅰ和100 U/mL透明质酸酶来分离刚出生未进奶的山羊小肠上皮细胞,二次消化获得完整隐窝单位,并具有较强的增殖能力,倒置显微镜下观察培养细胞为多边形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列。联合使用刮除法、相差消化法、相差贴壁法纯化获得的原代细胞,得到纯度达80%的第三代小肠上皮细胞。用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶消化原代可以获得IEC,但是传代后细胞难以贴壁,增殖能力弱;胶原酶Ⅰ消化获得的细胞大部分都为成纤维细胞。对获得的第三代小肠上皮细胞,用无限稀释法进行单细胞克隆,经过克隆的IEC能成功传代到第十代。对获得的山羊小肠上皮细胞系进行细胞生物学检测,包括细胞免疫组化鉴定、细胞生长动力学检测、不同冻存和复苏方法的研究。结果表明,免疫组化鉴定呈阳性;细胞冻存液Ⅰ、冻存方法Ⅲ能使细胞复苏成活率达到85%,复苏后的山羊小肠上皮细胞,其形态、增殖速度均与冻存前是一致的。本试验采用MTT显色法研究了谷氨酰胺、精氨酸以及两者联合对培养的第五代小肠上皮细胞生长和分化的影响,结果表明,谷氨酰胺和精氨酸均能促进IEC增殖,谷氨酰胺促进IEC分化,但是精氨酸抑制IEC分化,谷氨酰胺和精氨酸两者联合后尽管仍然有促进IEC生长的作用,但与谷氨酰胺单一因子的作用比较,联合后对肠上皮细胞的营养作用明显降低。同时以山羊小肠上皮细胞作为模型,体外培养该细胞过程中观察培养液氨基酸成分动态变化,来研究山羊小肠上皮细胞对氨基酸的代谢作用。结果表明,组氨酸、精氨酸、苏氨酸和亮氨酸是小肠上皮细胞快速利用的氨基酸,天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸是生成的氨基酸,其它氨基酸呈现平缓的被消耗状态。
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摘要Abstract文献综述1 动物细胞培养的研究进展2 小肠上皮细胞的研究进展2.1 小肠上皮细胞的结构及其功能2.2 小肠上皮细胞的分离纯化2.3 小肠上皮细胞系的研究进展3 小肠上皮细胞对氨基酸的利用研究3.1 谷氨酰胺对 IEC 的影响3.2 精氨酸对IEC 的影响3.3 IEC 对其它氨基酸的利用4 本论文研究的目的及意义试验部分第一章 山羊小肠上皮细胞的分离和纯化1 材料和方法1.1 试验材料1.2 山羊IEC 的分离1.3 山羊IEC 的纯化1.4 山羊IEC 的传代2 结果与分析2.1 山羊IEC 的分离方法2.2 山羊IEC 的纯化2.3 山羊IEC 的传代2.4 山羊小肠上皮细胞的形态学观察3 讨论3.1 组织来源3.2 培养条件3.3 分离方法3.4 纯化方法3.5 上皮细胞的传代4 小结第二章 山羊小肠上皮细胞的克隆和生物学检测1 材料与方法1.1 试验材料1.2 试验方法1.2.1 山羊IEC 的克隆1.2.2 山羊IEC 的免疫组化鉴定1.2.3 山羊IEC 生长动力学检测1.2.4 山羊IEC 冻存、复苏的研究2 结果2.1 山羊IEC的克隆2.2 山羊IEC 免疫组化鉴定2.3 山羊IEC生长动力学检测2.4 山羊IEC冻存、复苏的研究3 讨论3.1 山羊IEC的克隆3.2 山羊IEC的免疫组化鉴定3.3 山羊IEC活力与生长曲线3.4 冻存液与冻存保护剂3.5 降温的速率与复苏速率4 小结第三章 山羊小肠上皮细胞对氮素的利用研究1 材料与方法1.1 试验材料1.2 试验方法1.2.1 不同浓度Gln、Arg 及两者联合对山羊IEC 生长的影响1.2.2 新生山羊小肠上皮细胞对氨基酸的代谢利用1.3 计算方法与统计分析2 结果2.1 不同浓度Gln 对山羊IEC 生长的影响2.2 不同浓度Arg 对山羊IEC 生长的影响2.3 不同浓度Gln+Arg 对山羊IEC 生长的影响2.4 Gln 组第六天时 ALP 和 CK 活性变化2.5 Arg 组第六天时 ALP 和 CK 活性变化2.6 Gln+Arg 组第六天时 ALP 和 CK 活性变化2.7 山羊小肠上皮细胞对氨基酸的代谢利用3 讨论3.1 不同浓度Gln 对山羊IEC 生长的影响3.2 不同浓度Arg 对山羊IEC 生长的影响3.3 不同浓度Gln+Arg 对山羊IEC 生长的影响3.4 山羊小肠上皮细胞对氨基酸的代谢利用4 小结结论与研究展望参考文献致谢攻读学位期间发表的学术论文目录
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