单层贴壁法诱导人胚胎干细胞向平滑肌细胞分化及其机制初探

论文摘要

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）是从囊胚中内细胞团（Inner mass cells，ICM）或原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）分离和克隆的多能性细胞，具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，能够在体内或体外分化为成体中任何细胞类型。ES细胞作为体外理想的细胞模型，可以研究真核细胞在早期胚胎发育时期基因的表达和调控；也为未来的细胞治疗和再生医学带来了希望。平滑肌细胞作为构成血管壁的组织单元及维持血管张力的主要细胞成份，其分化和增殖在血管发生以及动脉粥样硬化、癌症和高血压等疾病中起着重要作用。培养的平滑肌很难稳定维持在一种表型，这在很大程度上限制了人们对其调控机理和途径的研究，利用可诱导的SMC体外分化系统对于进行SMC分子机制研究具有重要的价值。迄今为止，还没有体外定向诱导人胚胎干细胞分化为平滑肌的报道。此外人胚胎干细胞分化为其他细胞谱系也由于分化效率和均一性等问题也限制了其在医学治疗上的应用。本文我们首次将人胚胎干细胞（hESC）定向分化成平滑肌细胞（SMC）。通过单层贴壁途径，利用高浓度的维甲酸（10μMRA）诱导10天后，经流式细胞仪检测SMα-actin阳性细胞高达93％，结合细胞形态、RT-PCR、免疫荧光细胞化学、western blot、对促收缩剂刺激的响应、出现自发收缩等指标检测，显示诱导的细胞具有平滑肌细胞的典型特征。该方法的优点是不通过拟胚体途径、没有基质细胞共培养、不经过细胞分选过程，其诱导程序简单，诱导效率高。这种单因子，单层、高效率的体外诱导系统为研究平滑肌细胞发育的分子调控机理提供了一个极佳的平台，此外高纯度的诱导为将来细胞治疗相关疾病提供了良好的细胞资源。为了进一步探索RA在高效诱导hES分化为SMC的作用机制，我们从RA代谢系统的关键酶CYP26s入手，分析了诱导过程中CYP26s，RARs和RXRs等基因的表达变化，并研究维甲酸代谢抑制剂、RA加入的时间及其持续处理时间对SMC分化效率的影响。我们揭示了高浓度RA在hES细胞单层贴壁高效分化为SMC中的诱导和促凋亡的双重效应。在RA的作用下，由于RA的多生物学效应，ES细胞启动了向多种细胞谱系的分化（包括SMC谱系），然而分化早期诱导出的各种祖细胞由于CYP26s的表达不同，失活RA的能力出现了明显差异，这些差异促使部分细胞（SMC前体细胞）由于CYP26s的高表达从而能够逃脱凋亡命运，最终使得ES细胞高效分化成为SMC。目前ES分化策略大部分是采用拟胚体的方法，拟胚体能够模拟胚胎发育早期的各种事件，但也存在诸如分析分选困难、细胞间有着复杂的相互作用等弊端。为使得分化为特定细胞的效率更高，并能方便研究驱动体外定向分化早期事情的分子机制，我们发展并完善了单层贴壁方法。单层贴壁进行分化研究的前提就是要获得高活力、高纯度的ES细胞，因此本实验利用胚胎干细胞与饲养层细胞贴壁速度的差异，建立了一种简单快速的分离MEF和ES细胞的差速贴壁方法。结果表明，在0.5％明胶包被的培养器皿中，差速贴壁1.5小时是分离ES细胞与MEF的最佳时间，此时流式细胞统计MEF仅占细胞群体2.4％。通过对差速贴壁前后的ES细胞进行碱性磷酸酶、单克隆形成率、ES细胞特异性标志、三胚层分化潜能等指标比较，证明纯化后的ES细胞仍保持高活力、未分化状态，这为后续进行ES细胞单层贴壁分化提供了条件。此方法不仅对ES细胞的干性无明显影响，可进行后续的分化实验，而且与其他去除饲养层的方法相比还具有高效、经济、快速、简单等优点。为通过单层贴壁途径进行ES细胞定向分化研究解决了细胞材料问题。在建立了单层贴壁分化ES细胞系统基础上，我们尝试将组蛋白脱乙酰酶抑制剂（丁酸钠）应用于神经细胞分化的研究，使得ES细胞定向分化为神经细胞的周期更短，效率更高，操作更简便。利用组蛋白脱乙酰酶抑制剂—NaB打破组蛋白乙酰化的平衡，促使染色质松散，从而抑制胚胎干细胞增殖，使起尽快步入分化状态，随即采用单层贴壁培养分化的方法结合添加神经诱导培养液N2827使其分化成神经细胞。结果表明此方法可获得高比例的神经细胞，在分化第4～6天时以nestin阳性的神经祖细胞为主，分化两周后就可产生大量表达GFAP的星性胶质细胞及表达β-tubulinⅢ的神经元。通过LAPS芯片检测诱导出的神经元具有放出惊厥样电位的功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 血管平滑肌的起源
• 2.1 胚胎发育期血管平滑肌的来源
• 2.2 成体中的血管平滑肌细胞的来源
• 3 血管平滑肌表型转化（可塑性）
• 3.1 血管平滑肌的异质性
• 3.2 血管平滑肌表型可塑性
• 3.2 平滑肌分化和去分化的标志
• 3.3 细胞外基质（ECM）和外源生化因子对平滑肌表型的影响
• 3.4 染色质修饰在SMC分化中的作用
• 4 维甲酸在SMc增殖、分化及血管发育中的作用
• 4.1 维甲酸在SMC生长中的作用
• 4.2 维甲酸在血管发生和SMC分化中的作用
• 4.3 维甲酸对新生内膜形成的影响
• 4.4 未来方向
• 参考文献
• 第二章 单层贴壁直接诱导ES细胞分化系统的建立
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 差速贴壁过程的细胞形态观察
• 3.2 明胶浓度对细胞贴壁率的影响
• 3.3 贴壁时间对分离效率的影响
• 3.4 差速贴壁后ES细胞质量检测
• 4 讨论
• 图版
• 参考文献
• 第三章 单层帖壁诱导hES细胞向SMC定向分化
• 1 前言
• 2、材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 hES细胞的生长特性
• 3.2 RA浓度对SMC诱导的影响
• 3.3 hES细胞铺板密度对SMC诱导的影响
• 3.4 诱导分化细胞的基因表达鉴定
• 3.5 hES细胞起源的SMC的收缩功能鉴定
• 3.6 单层贴壁诱导hES细胞分化为SMC的效率及SMC群体的异质性
• 4 讨论
• 图版
• 参考文献
• 第四章 RA在hESC定向分化为SMC中机制初探
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 RA加入的初始时间对SMC诱导的影响
• 3.2 RA持续处理的时间对SMC诱导的影响
• 3.3 诱导过程的细胞形态变化
• 3.4 维甲酸代谢阻断剂（RAMBA）酮康唑对RA诱导ES细胞定向分化成SMC的影响
• 3.5 诱导过程中维甲酸受体和细胞色素CYP26s的基因表达变化
• 4 讨论
• 4.1 RA对SMC分化的诱导作用
• 4.2 RA在SMC分化中的选择性凋亡作用
• 图版
• 参考文献
• 第五章 单层贴壁法定向诱导ES细胞分化为神经细胞
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 细胞系
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 2.4 方法
• 3 结果
• 3.1 诱导过程的细胞形态观察
• 3.2 诱导过程的基因表达分析及免疫细胞化学鉴定
• 3.3 诱导细胞的电生理检测
• 4 讨论
• 图版
• 参考文献
• 附录
• 1 创新性
• 2 未解决的问题及其未来研究方向
• 3 主要试剂配方
• 4 缩略词表
• 致谢
• 在攻读博士期间发表和待发表的文章