马铃薯晚疫病水平抗性相关基因StPK1、StLRPK1、Star的克隆和功能分析

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界上第四大粮食作物,在全球工农业生产中均占有重要地位。联合国宣布2008年为“国际马铃薯年”,强调了马铃薯在全球粮食系统中的重要地位。马铃薯的生产受到多种病虫害的危害,其中由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是最具毁灭性的病害。马铃薯晚疫病的抗性通常分为垂直抗性和水平抗性。晚疫病原菌小种变异迅速,导致马铃薯晚疫病垂直抗性并不持久。水平抗性是由微效多基因控制的非小种专化抗性,对不同的生理小种都具有抗性,并且较为稳定、持久。但目前对于水平抗性机理的研究还很薄弱,极大限制了抗性资源的有效利用。本研究旨在通过3个水平抗性相关基因的克隆和功能分析,探索抗性机制,主要结果如下:1.用cDNA末端快速扩增（RACE）的方法,从马铃薯水平抗性材料（剔除R1-R11）中克隆了一个新的蛋白激酶基因StPK1（Solanum tuberosum protein kinases1）。该基因cDNA全长1779 bp,编码416个氨基酸。该基因全长gDNA序列中具有5个内含子和6个外显子。用马铃薯二倍体群体PCC1将该基因定位于第Ⅸ染色体。半定量RT-PCR结果表明,晚疫病病原菌接种1h后该基因开始表达,而且可以持续表达36h;2.用RACE的方法,从马铃薯水平抗性材料中克隆了一个新的富含亮氨酸重复的类受体蛋白激酶基因StLRPK1（Solanum tuberosum leucine-rich-repeatreceptor-like protein kinases 1）。该基因cDNA全长3137 bp,编码796个氨基酸,具有1个信号肽、5个亮氨酸模体、1个跨膜域、2个脯氨酸重复区和1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）SRF3有很高的同源性（88%）。半定量RT-PCR结果表明,该基因在花和幼叶中表达水平较高,被晚疫病原菌强烈诱导表达,并且受SA、MJ、ETH和ABA诱导时呈现不同的表达模式;3.用RACE的方法,克隆了一个马铃薯富含锚蛋白重复结构域的基因Star（Solanum tuberosum ankyrin-rich repeat）。该基因cDNA全长2047 bp,编码514个氨基酸,与水稻（Oryza sativa）Xa21结合蛋白3有较高的同源性（78%）,具有5个锚蛋白重复域和1个环指域。半定量RT-PCR结果表明,晚疫病病原菌接种24h时,该基因开始表达,随后逐步增强;2至36h,Star一直受SA、MJ、ABA的诱导,而只在24至36h受ETH诱导;4.分别构建了CaMV 35S驱动下的StPK1正义基因表达载体和StPK1干涉表达载体。以马铃薯试管薯为受体材料,用根癌农杆菌介导法,将上述载体导入马铃薯试管薯,分别获得“鄂马铃薯3号”（E3）正义超量表达株系15个,“转心乌”（W）正义超量表达株系8个,“鄂马铃薯3号”（E3）干涉株系22个。Southern杂交表明每个转基因植株有1-3个拷贝。晚疫病病原菌接种实验表明,与未转基因株系相比,干涉株系更抗病,而超量表达株系更感病,说明StPK1基因为马铃薯抗病反应中的负调控因子;5.为了研究StPK1基因负调控马铃薯抗病反应的分子机理,考察了11个马铃薯抗病基因在接种晚疫病原菌24h后在E3超量表达株系、E3和E3干涉株系中的表达。结果表明,有5个基因在StPK1超量表达株系中表达减弱,而在干涉株系中表达增强,这表明StPK1处于这5个基因的上游,且负调控它们的表达;6.SA、MJ、ETH和ABA处理马铃薯植株时,StPK1受SA诱导表达从2h一直持续到36 h,而受其它因子诱导并不强烈。用SA处理马铃薯植株的第3复叶,研究StPK1基因在1-6复叶的表达,结果表明,StPK1在1-6复叶中几乎可以等量表达,这表明SA无极性地向上、向下传递信号。此外,被StPK1负调控的5个基因也受SA诱导表达。由上述实验结果推测StPK1基因处于SA信号途径;7.分别构建了CaMV 35S驱动下的StLRPK1和Star正义基因表达载体。用根癌农杆菌介导法转化烟草,分别获得8个和7个转基因烟草株系,转基因植株晚疫病病原菌接菌试验表明,接种5d后,与未转基因烟草相比,超量表达株系更抗病,推测StLRPK1基因和Star基因为马铃薯抗病反应中的正调控因子。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 马铃薯晚疫病的危害
• 1.1.1 晚疫病病原
• 1.1.2 晚疫病为害症状
• 1.1.3 晚疫病的流行病学
• 1.1.4 晚疫病的危害与防治
• 1.2 马铃薯晚疫病抗性的分子遗传机制
• 1.2.1 垂直抗性
• 1.2.2 水平抗性
• 1.3 植物蛋白激酶研究
• 1.3.1 蛋白激酶的结构
• 1.3.2 蛋白激酶的分类和功能
• 1.4 本研究的目的、意义和主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 晚疫病原菌
• 2.1.3 菌种、质粒及分子生物学相关试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 离体叶片处理
• 2.2.2 活体叶片接种
• 2.2.3 质粒的小量提取
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.5 农杆菌感受态的制备及转化
• 2.2.6 农杆菌介导的植物遗传转化
• 2.2.7 植物基因组DNA的提取
• 2.2.8 转基因植株的Southern杂交
• 2.2.9 马铃薯叶片RNA的提取
• 2.2.10 RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends,cDNA末端快速扩增）
• 2.2.11 半定量RT-PCR
• 2.2.12 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 第三章 马铃薯StPK1基因cDNA、gDNA、启动子的克隆、定位及原核表达
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 RACE
• 3.2.3 分别在3个抗性基因型的gDNA中扩增StPK1全长cDNA和gDNA
• 3.2.4 马铃薯StPK1基因的定位
• 3.2.5 马铃薯StPK1基因启动子的克隆
• 3.2.6 烟草的遗传转化及GUS染色
• 3.2.7 马铃薯StPK1基因的原核表达
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 马铃薯StPK1基因cDNA的克隆
• 3.3.2 StPK1生物信息学分析
• 3.3.3 马铃薯StPK1全长gDNA的克隆
• 3.3.4 马铃薯StPK1基因的定位
• 3.3.5 马铃薯StPK1基因启动子的克隆
• 3.3.6 马铃薯StPK1基因启动子的活性分析
• 3.3.7 马铃薯StPK1基因的原核表达
• 3.4 讨论
• 第四章 马铃薯StPK1基因的表达研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 生物及非生物胁迫处理
• 4.2.2 StPK1在不同器官中的表达
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 接种晚疫病后StPK1基因的表达分析
• 4.3.2 4个信号分子对StPK1表达的影响
• 4.3.3 StPK1被SA诱导的深入研究
• 4.3.4 StPK1在不同器官中的表达
• 4.4 讨论
• 第五章 StPK1基因的功能研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 植物材料与菌株
• 5.2.2 StPK1基因超量表达载体的构建
• 5.2.3 StPK1基因干涉表达载体的构建
• 5.2.4 马铃薯遗传转化
• 5.2.5 再生植株的鉴定
• 5.2.6 晚疫病接种鉴定
• 5.2.7 马铃薯相关抗性基因在晚疫病原菌接种的转基因株系中的表达
• 5.2.8 马铃薯相关抗性基因在SA诱导后的表达
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 StPK1基因超量表达载体的构建
• 5.3.2 StPK1基因干涉表达载体的构建
• 5.3.3 马铃薯遗传转化
• 5.3.4 再生植株的鉴定
• 5.3.5 StPK1基因在马铃薯转基因株系中的表达研究
• 5.3.6 StPK1基因与马铃薯的抗病反应呈负相关
• 5.3.7 StPK1基因负调控下游抗性相关基因的表达
• 5.3.8 被StPK1基因负调控的5个基因受SA诱导表达
• 5.4 讨论
• 第六章 马铃薯StLRPK1基因的克隆、表达和功能初探
• 6.1 前言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 植物材料、菌株和试剂
• 6.2.2 RT-PCR、RACEs与全长StLRPK1 cDNA的克隆
• 6.2.3 StLRPK1基因超量表达载体的构建
• 6.2.4 StLRPK1基因转化烟草
• 6.2.5 再生植株的鉴定
• 6.2.6 StLRPK1转基因烟草的晚疫病接种分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 RT-PCR和StLRPK1全长cDNA的克隆
• 6.3.2 StLRPK1生物信息学分析
• 6.3.3 StLRPK1基因转录水平表达分析
• 6.3.4 StLRPK1基因超量表达载体的构建
• 6.3.5 StLRPK1基因转化烟草和再生植株的鉴定
• 6.3.6 StLRPK1转基因烟草的晚疫病接种分析
• 6.4 讨论
• 第七章 马铃薯Star基因的克隆、表达和转化烟草研究
• 7.1 前言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 Star全长cDNA的克隆及表达分析
• 7.2.2 Star基因超量表达载体的构建及转化烟草
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 RT-PCR,3'-RACE和5'-RACE
• 7.3.2 Star生物信息学分析
• 7.3.3 Star基因转录水平表达分析
• 7.3.4 Star基因超量表达载体的构建
• 7.3.5 Star基因转化烟草
• 7.3.6 Star转基因烟草的晚疫病接种分析
• 7.3.7 烟草中克隆Star的同源基因
• 7.4 讨论
• 第8章 总讨论
• 8.1 StPK1在马铃薯晚疫病抗病反应过程中的可能机制
• 8.2 StLRPK1和Star在马铃薯晚疫病抗病反应过程中的作用
• 8.3 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1 ESTs原始序列
• 附录2 StPK1基因GenBank登记信息
• 附录3 StLRPK1基因GenBank登记信息
• 附录4 Star基因GenBank登记信息
• 附录5 博士在读期间已发表或接收的文章
• 致谢