人乳铁蛋白基因转化银耳的研究

论文摘要

乳铁蛋白是一种糖蛋白，为转铁蛋白家族的一员，在人和哺乳动物的许多器官与组织中广泛分布。乳铁蛋白具有多种生物学功能，这些功能包括：促进人体肠道对铁的吸收及调节体内铁的平衡；广谱抗菌（细菌和真菌）、抗病毒感染作用等。把人乳铁蛋白基因转入银耳中，让它合成具有生物活性的人乳铁蛋白，相当于在银耳中添加新的营养保健因子。乳铁蛋白强的铁螯合能力和广谱抗菌、抗病功能，可提高转基因银耳铁的含量，增强银耳抗菌、抗病能力。本研究在对银耳遗传转化标记进行筛选及对其遗传转化体系进行优化的基础上，构建了人乳铁蛋白基因银耳表达载体，在电激转化法介导下，首次把人乳铁蛋白基因导入银耳，获得了转基因银耳菌株。对转基因菌株进行分子检测，证实了外源基因已整合到银耳基因组中。具体结果如下：1．银耳遗传转化标记的筛选本实验对银耳的遗传标记进行了初步研究，以期对银耳转化载体选择和构建提供依据。测定了13种抗菌素对银耳Tr21芽孢的抑菌活性，Tr21能耐大多数的抗菌素，仅对卡那霉素、林可霉素、庆大霉素和潮霉素敏感。结果表明，潮霉素和卡那霉素可以作为银耳转化子选择性抗菌素。此外，还对银耳本身是否具有GUS活性进行了研究，实验结果表明银耳没有GUS背景，理论上讲，GUS可作为银耳芽孢遗传转化的报告基因。2．构建了银耳表达载体以质粒pBI121和pCAMBIA1301为出发质粒，把pBI121用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，回收带有35S启动子、Tnos终止子及GUS基因的片段，置换插入pCAMBIA1301的多克隆位点，获得重组中间质粒pCB。PCB带有pBI121片段，该片段中的GUS基因两侧有多个单酶切位点，可用于外源基因的置换。然后用BamHⅠ／SacⅠ双酶切处理质粒pUC-hlf和pCB，把pUC-hlf小片段与pCB大片段连接，把人乳铁蛋白基因亚克隆到重组中间质粒pCB上，置换GUS基因，获得携带人乳铁蛋白基因的银耳表达载体，定名为pCB-hlf。3．建立了高效的银耳遗传转化体系本实验研究了影响银耳的电激转化条件。实验结果表明，银耳的电激转化需要先对银耳芽孢进行预处理才能获得转化子，用2％溶壁酶处理1h效果最佳。电压300伏，电阻600欧姆，电容25微法为银耳的最适转化条件。此外，我们在电激缓冲液中加入浓度为7％PEG4000时，转化率得到较大提高，达到9.25×106个／μg质粒DNA。4．人乳铁蛋白基因转化银耳及分予检测利用电激介导转化法，把携带人乳铁蛋白基因的银耳表达载体pCB-hlf导入银耳中，获得了大量的抗性菌株。通过对抗性菌株进行抗性鉴定、GUS活性检测、PCR检测、Southern杂交证实了外源基因已整合到抗性菌株基因组DNA中。对转基因菌株进行RT-PCR检验，得到了阳性结果，说明外源基因在银耳中能正常转录。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.人乳铁蛋白及其遗传转化研究进展
• 1.1 乳铁蛋白的结构与功能
• 1.2 人乳铁蛋白转基因研究
• 1.3 对重组人乳铁蛋白主要理化性质和生物活性的分析
• 1.4 人乳铁蛋白转基因研究的展望
• 2.食用菌遗传转化研究进展
• 2.1 筛选标记
• 2.2 启动子
• 2.3 遗传转化方法
• 3.银耳的食药用价值与品质改良
• 3.1 银耳的食药用价值
• 3.2 银耳的遗传育种
• 3.3 银耳品质改良的研究
• 4.本研究的目的和意义
• 第二章 银耳遗传转化标记
• 1.材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 实验方法
• 2.结果和讨论
• 2.1 抗药性标记筛选
• 2.2 GUS活性检测
• 3.讨论
• 第三章 人乳铁蛋白基因银耳表达载体构建
• 1.材料与方法
• 1.1 供试菌株与质粒
• 1.2 生化试剂
• 1.3 实验方法
• 2.结果与分析
• 2.1 hlf基因银耳表达载体的构建技术路线图
• 2.2 重组质粒的鉴定
• 第四章 银耳遗传转化体系的建立
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 1.4 质粒DNA的分离提纯
• 1.5 银耳芽孢预处理
• 1.6 转化方法
• 1.7 计算与统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 芽孢预处理对质粒DNA转化率的影响
• 2.2 电压对质粒DNA转化率的影响
• 2.3 电激缓冲液对质粒DNA转化率的影响
• 2.4 质粒浓度对质粒DNA转化率的影响
• 3.小结
• 4.讨论
• 第五章 人乳铁蛋白基因转化银耳及表达研究
• 1.材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 寡聚核苷酸引物
• 1.5 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 转化结果
• 2.2 转化子抗性药鉴定
• 2.3 GUS活性检测
• 2.4 hlf转化子的分子检测
• 2.5 转化子的Southern杂交
• 2.6 转化子的RT-PCR
• 3.小结
• 4.讨论
• 参考文献
• 致谢