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黄原胶生物降解及其寡糖生理活性的研究

2020-12-05阅读(86)

黄原胶生物降解及其寡糖生理活性的研究

论文摘要

功能性寡糖多来自于细胞壁多糖水解,在植物诱抗、抑制病原菌、增强免疫力、改善胃肠功能等方面具有重要生理活性。黄原胶是植物致病菌野油菜黄单胞菌所分泌的胞外多糖,其主链类似纤维素很难降解,除作为生物胶集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体外,还是植物毒素因子,能引起十字花科植物黑腐病。本论文研究目的是通过生物方法降解黄原胶,进而去除十字花科植物黑腐病的毒素因子,同时探讨黄原胶降解后所产寡糖是否具有特殊的生理活性。从土壤中分离出黄原胶降解菌株XT11。经菌体表观特征、菌落形态、生理生化鉴定等传统细菌分类鉴定,以及G+C含量、16S rRNA基因序列相似性比对和系统发育分析等现代分子生物学鉴定,最终确定菌株XT11是微杆菌属Microbacterium一新种。与M.hydrocarbonoxydans亲缘关系最近,相似性97.8%,遗传距离0.008。黄原胶降解菌株XT11的16S rRNA基因序列GenBank登陆号为DQ350882。同时对微杆菌属的进化遗传关系进行聚类分析,微杆菌属共分两大簇群,其中黄原胶降解菌XT11与近缘菌M.hydrocarbonoxydans构成一子分支,置信度为85%。降解菌Microbacterium sp.XT11分泌胞外黄原胶降解酶,降解黄原胶主链使其粘度降低,产黄原胶寡糖。黄原胶降解酶为底物诱导酶。黄原胶、CMC、淀粉、麦芽糖等结构相似,均是其诱导剂,其中黄原胶诱导作用最佳。黄原胶降解菌XT11适宜发酵产酶条件为:0.3%黄原胶、0.3%酵母浸粉的基础培养基,初始pH7.0,28℃160r/min溶氧培养。培养基外加葡萄糖,虽促进XT11菌体自身生长,但却抑制黄原胶诱导产酶。蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉和纤维素等碳源,也不同程度抑制黄原胶降解酶的诱导合成。从黄原胶降解菌XT11发酵产酶特性来看,随着发酵培养时间延长,降解菌不断增长,发酵液粘度迅速下降,黄原胶降解酶活力逐渐上升。发酵28h时酶活达到最高23U/mL。黄原胶降解酶酶学性质初步分析表明,作用黄原胶最适反应温度40℃,最适反应pH值6.0,最适底物浓度0.4%（w/v）。当葡萄糖浓度高于0.06%时,对黄原胶降解酶的酶促反应具有抑制作用。且葡萄糖浓度越高,抑制作用越强。黄原胶降解酶使酶解反应液粘度和还原糖含量呈现良好的对应关系,说明黄原胶类似纤维素的主链发生降解,这正是黄原胶降解产生寡糖所必需的。黄原胶降解菌XT11降解黄原胶可得到不同粘度/还原糖比值的黄原胶寡糖。黄原胶降解寡糖生理活性研究表明,黄原胶自身无清除自由基能力,其降解寡糖却具有清除羟基自由基活性,且活性与寡糖浓度基本呈正相关。寡糖聚合度是影响活性的主要因素,其中黄原胶寡糖S6（粘度/还原糖比40.9）羟基自由基清除能力最强。黄原胶寡糖只抑制植物病原菌野油菜黄单胞菌Xanthomonas campetris生长,而对大肠杆菌Esherichiacoli、胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora,伤寒沙门氏菌Salmonella typhi、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、变形链球菌Streptococcus mutans、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis等其它供试病原菌均无抑制作用。黄原胶寡糖使大豆子叶呈现诱抗活性,诱导植物产生防御反应,提高植物抗病性。进一步研究发现,黄原胶寡糖S4、S5（粘度/还原糖比分别为232.5和101.4）对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xcc）抑菌活性尤为显著。黄原胶寡糖不仅抑制野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xcc）生长,还阻止其合成毒素因子黄原胶。同时,黄原胶寡糖还部分抑制野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xcc）所分泌的作为致病因子的某些酶的活性,如纤维素酶、几丁质酶、果胶酶和蛋白酶等。总之,黄原胶寡糖有明显的防治野油菜黄单胞菌引起十字花科植物黑腐病的生理活性,有开发为生物农药的潜在优势。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 文献综述
  • 1.1 寡糖及其生理活性
  • 1.1.1 寡糖分类
  • 1.1.2 寡糖主要生理活性
  • 1.1.3 寡糖生产
  • 1.1.4 寡糖应用
  • 1.2 黄原胶
  • 1.2.1 黄原胶结构
  • 1.2.2 黄原胶理化特性
  • 1.2.3 黄原胶应用
  • 1.3 野油菜黄单胞菌与黑腐病
  • 1.3.1 黄单胞菌
  • 1.3.2 野油菜黄单胞菌野油菜黑腐致病变种
  • 1.3.3 黑腐病致病机理
  • 1.4 寡糖素与植物诱抗
  • 1.4.1 植物诱抗剂及其分类
  • 1.4.2 寡糖诱抗剂（寡糖素）
  • 1.4.3 植物抗病机理
  • 1.4.4 寡糖素在植物防卫中作用
  • 1.4.5 植物诱抗与生物农药
  • 1.5 黄原胶降解
  • 1.6 论文研究内容
  • 参考文献
  • 2 黄原胶降解菌XT11的筛选分离及鉴定
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 实验仪器
  • 2.1.3 分析方法
  • 2.1.4 黄原胶降解酶活力测定:粘度降低法
  • 2.1.5 黄原胶降解菌的筛选分离
  • 2.1.6 黄原胶降解菌的表观形态和菌落特征
  • 2.1.7 黄原胶降解菌的生理生化鉴定
  • 2.1.8 DNA的G+C含量测定
  • 2.2 实验结果
  • 2.2.1 黄原胶降解菌的筛选分离
  • 2.2.2 黄原胶降解菌表观形态和菌落特征
  • 2.2.3 黄原胶降解菌的生理生化特性
  • 2.2.4 黄原胶降解菌G+C含量测定
  • 2.3 讨论
  • 2.4 小结
  • 参考文献
  • 3 黄原胶降解菌XT11的16S rRNA基因序列分析
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.2 实验仪器
  • 3.1.3 黄原胶降解酶活力测定:粘度降低法
  • 3.1.4 基因组DNA提取
  • 3.1.5 PCR扩增16S rRNA基因和产物纯化
  • 3.1.6 16S rRNA基因序列测定
  • 3.1.7 16S rRNA基因序列相似性分析及系统进化树构建
  • 3.2 实验结果
  • 3.2.1 基因组DNA提取
  • 3.2.2 PCR扩增16S rRNA基因和产物纯化
  • 3.2.3 黄原胶降解菌XT11的16S rRNA基因序列特征
  • 3.2.4 黄原胶降解菌XT11的16S rRNA基因序列相似性分析及系统发育树的构建
  • 3.3 讨论
  • 3.4 小结
  • 参考文献
  • 4 黄原胶降解菌XT11发酵产酶条件的研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.2 实验仪器
  • 4.1.3 分析方法
  • 4.1.4 黄原胶降解酶活力测定:粘度降低法
  • 4.1.5 营养条件对黄原胶降解菌XT11产酶的影响
  • 4.1.6 发酵条件对黄原胶降解菌XT11产酶的影响
  • 4.1.7 黄原胶降解菌XT11发酵产酶特性
  • 4.1.8 葡萄糖对黄原胶降解菌XT11诱导产酶的影响
  • 4.2 结果与讨论
  • 4.2.1 营养条件对黄原胶降解菌XT11产酶的影响
  • 4.2.2 发酵条件对黄原胶降解菌XT11产酶的影响
  • 4.2.3 黄原胶降解菌XT11发酵产酶特性
  • 4.2.4 葡萄糖对黄原胶降解菌XT11诱导产酶的影响
  • 4.3 小结
  • 参考文献
  • 5 黄原胶降解酶性质的初步研究
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 实验材料
  • 5.1.2 实验仪器
  • 5.1.3 分析方法
  • 5.1.4 黄原胶降解酶活力:粘度降低法
  • 5.1.5 黄原胶寡糖诱抗活性:改良大豆子叶法
  • 5.1.6 黄原胶降解酶的最适酶解温度
  • 5.1.7 黄原胶降解酶的最适酶解pH值
  • 5.1.8 黄原胶降解酶的酶解底物浓度确定
  • 5.1.9 葡萄糖对黄原胶降解酶酶促反应的作用
  • 5.1.10 黄原胶降解酶对黄原胶的生物降解
  • 5.2 结果与讨论
  • 5.2.1 黄原胶降解酶的最适酶解温度
  • 5.2.2 黄原胶降解酶的最适酶解pH值
  • 5.2.3 黄原胶降解酶的酶解底物浓度确定
  • 5.2.4 葡萄糖对黄原胶降解酶酶促反应的作用
  • 5.2.5 黄原胶降解酶对黄原胶的生物降解
  • 5.3 小结
  • 参考文献
  • 6 黄原胶寡糖生理活性的研究
  • 6.1 材料与方法
  • 6.1.1 实验材料
  • 6.1.2 实验仪器
  • 6.1.3 分析方法
  • 6.1.4 黄原胶降解酶活力测定:粘度降低法
  • 6.1.5 黄原胶降解酶的制备
  • 6.1.6 黄原胶寡糖的制备
  • 6.1.7 黄原胶寡糖抑菌活性测定:琼脂扩散法
  • 6.1.8 体外清除羟基自由基活性测定:Fenton反应
  • 6.1.9 黄原胶寡糖诱抗活性:改良大豆子叶法
  • 6.2 实验结果
  • 6.2.1 黄原胶寡糖的制备
  • 6.2.2 黄原胶寡糖的抑菌活性
  • 6.2.3 黄原胶寡糖的清除羟基自由基活性
  • 6.2.4 黄原胶寡糖的诱抗活性
  • 6.3 讨论
  • 6.4 小结
  • 参考文献
  • 7 黄原胶寡糖抑制植物致病菌野油菜黄单胞菌的研究
  • 7.1 材料与方法
  • 7.1.1 实验材料
  • 7.1.2 实验仪器
  • 7.1.3 分析方法
  • 7.1.4 黄原胶降解酶活力测定:粘度降低法
  • 7.1.5 纤维素酶活力测定
  • 7.1.6 蛋白酶活力测定
  • 7.1.7 几丁质酶活力测定
  • 7.1.8 果胶酶活力测定
  • 7.1.9 黄原胶寡糖抑菌活性测定:琼脂扩散法
  • 7.1.10 黄原胶寡糖的最低抑菌浓度（MIC）测定:肉汤连续稀释法
  • 7.1.11 黄原胶降解酶的制备
  • 7.1.12 黄原胶寡糖的制备
  • 7.1.13 黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌的细胞生长和产黄原胶的影响
  • 7.1.14 黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌分泌胞外酶的影响
  • 7.2 实验结果
  • 7.2.1 黄原胶寡糖制备和目的病原菌敏感性分析
  • 7.2.2 黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌的抑菌特性
  • 7.2.3 黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌产黄原胶的影响
  • 7.2.4 黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌所分泌胞外酶的影响
  • 7.3 讨论
  • 7.4 小结
  • 参考文献
  • 结论
  • 创新点
  • 展望
  • 附录A 黄原胶降解菌XT11的16S rRNA基因序列测序图谱
  • 附录B 黄原胶降解菌XT11的16S rRNA的NCBISequence Niewer"DQ350882.Microbacterium sp…[gi:85542647]"
  • 攻读博士学位期间发表学术论文情况
  • 致谢

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