平邑甜茶多胺合成关键酶基因的克隆、表达及其对胁迫的响应

论文摘要

本实验以当年生平邑甜茶（Malus hupehensis（Pamp） Rehd.）幼苗和三年生幼树为试材,克隆了平邑甜茶多胺合成的三个关键酶的基因（分别为精氨酸酶,精氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶）,探讨了这些基因在平邑甜茶幼树和幼苗的不同发育时期及不同器官的表达情况,研究了盐胁迫和重金属胁迫下平邑甜茶多胺的合成途径,探讨了外源多胺缓解重金属胁迫对平邑甜茶的伤害的机制。主要实验结果如下:1.根据已知蛋白基因序列设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术获得了平邑甜茶的精氨酸酶、精氨酸脱羧酶基因和鸟氨酸脱羧酶基因,分别命名为MhArg、MhADC和MhODC,并在Genebank分别注册为EF427896、EU431331、EU431332。2.平邑甜茶幼树和幼苗的不同发育时期及不同器官的表达情况表明MhArg在贮藏营养转换期表达量高,而MhODC和MhADC多在幼嫩组织表达。3.在盐胁迫下,MhADC的表达量随处理时间而逐渐增大,叶片中处理6h达到高峰,而根中3h就达到表达高峰。MhODC在叶片中表达量受盐胁迫影响不明显,不过在根中24h时表达量明显升高。在盐胁迫下平邑甜茶体内腐胺含量明显上升,12h达到高峰,后下降,而精胺和亚精胺含量明显下降。在重金属胁迫明显促进了MhODC的表达,而对MhADC表达的诱导不明显。重金属胁迫下明显促进腐胺的积累,亚精胺含量下降,而精胺含变化较平稳。平邑甜茶在重金属和盐胁迫下多胺的合成主要是依靠ADC途径。相比盐胁迫在重金属胁迫下平邑甜茶腐胺的积累更多地依赖ODC途径。4.在氯化镉胁迫下,外源多胺可以明显增加平邑甜茶叶片中的内源Spd和Spm的含量,降低Put的含量,从而明显提高（Spd+Spm）/Put的值,通过提高抗氧化酶的活性,增强了直接清除活性氧的能力,从而减轻了氯化镉胁迫下的膜质过氧化,减轻了重金属胁迫对平邑甜茶的伤害。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 概述
• 1.2 植物体内多胺的代谢
• 1.3 多胺在植物生长发育中的作用
• 1.3.1 多胺与果树萌发
• 1.3.2 多胺参与根的生长发育
• 1.3.3 多胺与衰老
• 1.4 多胺与植物逆境胁迫的关系
• 1.4.1 多胺与酸胁迫
• 1.4.2 多胺与渗透胁迫、盐胁迫和干旱胁迫
• 1.4.3 多胺与重金属胁迫
• 1.5 多胺的作用机理
• 1.5.1 清除体内活性氧自由基
• 1.5.2 调节膜的物理化学性质
• 1.5.3 多胺可以作为植物激素作用的媒介
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验设计
• 2.2.1 多胺合成相关酶基因的克隆及序列分析
• 2.2.2 平邑甜茶不同发育期多胺合成酶基因的表达分析
• 2.2.3 平邑甜茶不同器官多胺合成酶基因的表达
• 2.2.4 胁迫下平邑甜茶多胺含量及其合成途径分析
• 2.2.5 外源多胺对氯化镉胁迫下对平邑甜茶的影响
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 植物材料总RNA 的提取
• 2.3.2 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.3.3 cDNA 末端加尾
• 2.3.4 精氨酸酶基因的扩增条件和程序
• 2.3.5 精氨酸脱羧酶基因的扩增条件和程序
• 2.3.6 鸟氨酸脱羧酶基因的扩增条件和程序
• 2.3.7 PCR 产物的克隆
• 2.3.8 序列测定
• 2.3.9 Northern Blot
• 2.3.10 荧光定量PCR
• 2.3.11 多胺含量的测定
• 2.3.12 抗氧化酶活性的测定
• 2.3.13 可溶性蛋白和丙二醛含量的测定
• 2.3.14 超氧阴离子自由基的产生速率的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA 的提取及质量检测
• 3.2 平邑甜茶精氨酸酶基因的克隆与序列序列分析
• 3.3 平邑甜茶精氨酸脱羧酶基因的克隆与序列分析
• 3.4 平邑甜茶鸟氨酸脱羧酶基因的克隆与序列分析
• 3.5 平邑甜茶不同发育期多胺合成关键酶基因的表达分析
• 3.5.1 幼苗生长期多胺合成酶基因的表达特性
• 3.5.2 萌芽前后叶片多胺合成酶基因的表达特性
• 3.6 平邑甜茶不同器官多胺合成酶基因的表达
• 3.6.1 幼苗不同器官多胺合成酶基因的表达特性
• 3.6.2 幼树不同器官多胺合成关键酶基因表达特性
• 3.7 胁迫下平邑甜茶多胺含量及其合成途径分析
• 3.7.1 氯化钠对多胺含量与ADC 和ODC 基因表达的影响
• 3.7.2 氯化镉对多胺含量与ADC 和ODC 基因表达的影响
• 3.7.3 D-精氨酸对胁迫下多胺合成的影响
• 3.8 外源多胺对氯化镉胁迫下平邑甜茶的影响
• 3.8.1 氯化镉胁迫下平邑甜茶内源多胺含量的变化
• 3.8.2 外源亚精胺对氯化镉胁迫伤害的缓解作用
• 3.8.3 外源精胺对氯化镉胁迫伤害的缓解作用
• 4 讨论
• 4.1 不同发育期和不同器官多胺合成酶基因的表达分析
• 4.2 胁迫下平邑甜茶多胺含量及其合成途径分析
• 4.3 外源多胺对氯化镉胁迫下对平邑甜茶的影响
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况