论文摘要
第一部分槲皮素对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响目的： 槲皮素（Quercetin）是一种天然的黄酮类化合物,具有抗炎和抗肿瘤的作用。本部分重点研究槲皮素对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞（Rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）凋亡（Apoptosis）的影响。为槲皮素治疗RA提供相关的理论依据。方法： 39例新鲜的RA滑膜组织取材于郑州大学第一附属医院骨科因RA行全膝关节置换术的患者。RA的诊断标准符合美国风湿病学协会（ACR）修订的诊断标准。RA病人的关节滑膜组织采用胰蛋白酶消化法分离类风湿性关节炎患者的滑膜细胞。用光学显微镜（Light microscope）观察细胞的形态,流式细胞术（Flow cytometry,FCM）分析体外培养的RAFLSs表面标记的白细胞分化抗原3（Cluster of differentiation 3,CD3）、CD19、CD14、以及CD90的表达情况。选用不同浓度的槲皮素（0,100,200,300μm）处理RAFLSs24小时。利用DNA片段化（DNA fragmentation assay）凋亡检测法检测槲皮素处理对RAFLSs凋亡率的影响。利用蛋白质印迹法（Western blot）检测槲皮素对RAFLSs中凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-3（Caspase-3;激活型）和半胱氨酸天冬氨酸酶Caspase-9;激活型)的影响。并通过比较目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度比值研究槲皮素对RAFLSs中凋亡相关蛋白表达的影响。同时利用试剂盒检测Caspase-3和Caspase-9酶的活性。并计算不同槲皮素处理的RAFLSs中Caspase-3或者Caspase-9酶的活性与未处理组中对应的Caspase-3或者Caspase-9酶的活性的比值,研究槲皮素对RAFLSs中Caspase-3和Caspase-9酶活性的影响。利用流式细胞术以罗丹明123（Rhodamine 123）为荧光指示剂检测各种浓度槲皮素处理的RAFLSs中线粒体跨膜电位的变化（△ψm）情况,分析槲皮素对RAFLS线粒体跨膜电位的影响。Western blot法检测RAFLS细胞质中细胞色素C（Cytochrome C,cyt C）的表达情况,通过计算与比较Cyt C/β-actin灰度比值分析槲皮素对RAFLS细胞质中Cyt C表达的影响。同时利用Western blot法检测槲皮素对RAFLSs中促凋亡蛋白Bax（Bcl-2 associated X protein,Bax）和抗凋亡蛋白Bcl-2（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）的影响,并通过灰度分析,计算比较槲皮素对Bax/Bcl-2比值的影响。结果： 分离出的RAFLS中CD90表达的阳性率大于95%,CD14表达的阳性率小于2%,CD19表达的阳性率小于1%,CD3表达的阳性率小于1%。相差显微镜下可以看到RAFLSs贴壁生长,形态均一,呈长梭形,折光性强,两极胞突细长,末端多与邻近细胞交织成网状,RAFLSs核位于细胞中央,呈椭圆形,胞浆透亮,局部排列呈极向性。与未经槲皮素处理的对照组相比,槲皮素处理的RAFLS的凋亡率显著增加,而且成剂量依赖关系。槲皮素能够明显的促进激活型caspase-3和caspase-9的表达,而且增强两者的活性。槲皮素还能够显著降低RAFLSs中线粒体的跨膜电位,而且呈剂量依赖关系。与未经槲皮素处理的RAFLSs相比,在槲皮素处理的RAFLS细胞质中Cyt C的表达也也显著增强,Bax/Bcl-2的比值显著升高。结论： 槲皮素能够促进RAFLSs的凋亡,这可能与其促进RAFLSs中激活型Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达并增强其活性,降低RAFLS线粒体跨膜电位,增加RAFLS细胞质中Cyt C的表达,以及增强RAFLSs中促凋亡蛋白Bax/凋亡蛋白Bcl-2的比值有关。第二部分p53在槲皮素诱导的人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡中的作用目的： p53是肿瘤抑制因子,在细胞凋亡过程中起着重要的作用。本部分重点研究p53在槲皮素诱导的RAFLS细胞凋亡过程中的作用,为理解槲皮素诱导RAFLS细胞凋亡的机制提供理论依据。方法： 用不同浓度的槲皮素（0,100,200和300μm）处理RAFLSs24小时。利用Western blot法检测槲皮素对RAFLSs中p53蛋白磷酸化水平,并通过计算磷酸化的p53蛋白/内参蛋白（β-actin）的灰度比值来研究槲皮素对RAFLSs中p53蛋白磷酸化水平的影响。用不同浓度（0,10,20和30μm）的p53抑制剂pifithrin-alpha（PFT-α）预先处理RAFLSs30分钟,然后再用200μm的槲皮素处理RAFLSs24小时。收集受到不同处理的RAFLSs,利用Western blot法检测不同浓度PFT-α对槲皮素介导的p53磷酸化水平增强的影响。应用阳离子脂质体（Cationic lipopolyamines）转染试剂转染对照小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）或p53特异si RNA至RAFLSs中。转染后4小时,用新鲜培养基替换RAFLSs中的转染用的培养基。然后,经过不同浓度的槲皮素（0,100,200和300μm）处理RAFLSs24小时后,利用Western blot检测总的p53蛋白的表达水平;应用DNA片段化法检测RAFLSs的凋亡率。结果： Western blot法显示槲皮素能够促进p53的磷酸化,而且成剂量依赖关系。与对照组未经PFT-α预处理的RAFLSs相比,利用PFT-α预处理RAFLSs能够显著抑制槲皮素诱导的促进p53蛋白磷酸化的作用,而且呈剂量依赖关系。DNA片段化法表明,PFT-α预处理还能够显著抑制槲皮素介导的促进RAFLSs凋亡的作用。Western blot分析表明转染p53特异si RNA导致RAFLSs中剩余的内源性总p53蛋白表达水平是对照组中内源性总p53蛋白表达水平的13.2±2.5%（2mg si RNA）和3.1±0.4%（5mg si RNA）。在分子水平上,p53蛋白水平敲低显著抑制槲皮素诱导的RAFLSs的凋亡。结论： 槲皮素可促进RAFLSs中p53蛋白的磷酸化;PFT-α预处理能够抑制槲皮素诱导的对p53磷酸化和RAFLS凋亡的促进作用;靶向抑制内源性总p53蛋白表达可抑制槲皮素诱导的促RAFLS凋亡的作用。我们的结果提示,槲皮素介导的促RAFLS凋亡的作用可能与槲皮素促进p53蛋白磷酸化有关。
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