Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响

论文摘要

本研究系统评述了目前哺乳动物卵泡和卵母细胞发生分子调控机制的研究进展,探讨了生殖系a因子(Figla)和脑源性神经生长因子(BDNF)在猪和牛卵母细胞和胚胎的表达情况,进一步优化了猪和牛早期胚胎的体外培养体系。研究中首次克隆获得牛生殖系a因子全长cDNA序列585bp,编码194个氨基酸的成熟蛋白,其功能保守区与小鼠、人和类人猿等哺乳动物的同源性达到了90%以上;优化了SYBR Green I实时荧光定量PCR技术,使之能对牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因的表达进行较为准确的检测分析,从而使对微量材料进行大量的基因表达分析成为现实;首次证实了Figla和BDNF在猪和牛的卵母细胞和早期胚胎中均有表达,且BDNF在牛体细胞核移植囊胚中的表达量要显著低于体外受精和孤雌激活的囊胚;以现有培养体系为基础,添加BDNF可促进猪和牛体外培养的早期胚胎的发育。而添加神经生长因子(NGF)可促进牛体外培养的早期胚胎的发育。

论文目录

• 提要
• 第一篇 文献综述
• 第一章 卵泡和卵母细胞发生的分子调控机制
• 1 生殖系a 因子
• 2 新生卵巢同源盒基因
• 3 Oct4、Sox2 和 Nanog
• 4 KIT 配体（KITL）和 KIT
• 5 抗苗勒激素
• 6 叉头转录因子2
• 7 神经营养因子和它们的受体
• 8 生长分化因子9 和骨形态发生蛋白15
• 9 成纤维细胞生长因子2 和成纤维细胞生长因子7
• 10 白血病抑制因子
• 11 胰岛素样生长因子家族
• 12 类固醇
• 第二章 哺乳动物体外受精、孤雌激活和核移植技术的研究进展
• 1 体外受精
• 1.1 研究概况
• 1.2 研究方法及进展
• 2 孤雌生殖
• 2.1 研究概况
• 2.2 卵母细胞孤雌激活的方法
• 3 细胞核移植
• 3.1 研究进展
• 3.2 哺乳动物核移植的基本操作程序
• 第三章 哺乳动物卵母细胞的成熟和早期胚胎的体外培养
• 1 卵母细胞体外成熟
• 1.1 研究简史
• 1.2 卵母细胞体外成熟的主要环节
• 1.3 影响卵母细胞体外成熟的因素
• 2 胚胎的培养
• 2.1 胚胎的培养历史概况
• 2.2 培养液的种类，培养液的基本成分及其功用
• 第二篇 试验部分
• 第一章 Figla 基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Figla 基因的 PCR 扩增
• 2.2 克隆片断测序结果
• 2.3 基因结构分析
• 2.4 磷酸化位点和激酶特异磷酸化位点的预测
• 2.5 Figla 基因序列二级结构预测
• 2.6 三级结构预测
• 2.7 保守结构域预测
• 2.8 Figla 基因m RNA 在各组织间的表达情况
• 3 讨论
• 3.1 SMART 技术
• 3.2 Figla 及其相关基因序列分析
• 3.3 Figla 基因功能预测分析
• 4 小结
• 第二章 牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因表达的检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 内参引物的鉴定与选择
• 2.2 比较不同方法提取卵母细胞和胚胎total RNA
• 2.3 比较不同细胞保存方法对total RNA 提取的影响
• 2.4 比较不同保存方法对cDNA 品质的的影响
• 2.5 实时荧光定量 PCR 条件的优化
• 3 讨论
• 3.1 荧光染料法在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育相关基因研究中的应用
• 3.2 从微量细胞中提取 RNA 技术
• 3.3 引物对实时荧光定量 PCR 的影响
• 3.4 模板、引物模板配比关系对实时荧光定量 PCR 的影响
• 3.5 内参基因的选择对基因表达相对定量结果的影响
• 4 小结
• 第三章 Figla 基因和BDNF 基因在猪和牛卵母细胞和早期胚胎中定量表达的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 牛 IVF、PA 和 NT 胚胎的制备和培养
• 1.2 猪 PA 胚胎的制备和培养
• 1.3 囊胚冷冻
• 1.4 荧光定量 PCR 分析
• 1.5 BDNF 荧光染色
• 1.6 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 NT 胚胎的获得
• 2.2 猪和牛卵母细胞和早期胚胎的获得
• 2.3 引物的鉴定与选择
• 2.4 Figla 和 BDNF 基因表达水平
• 2.5 BDNF 在牛囊胚中的定位表达研究
• 3 讨论
• 3.1 基因表达的相对定量
• 3.2 Figla基因和BDNF基因在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中的表达
• 3.3 不同类型的胚胎在 mRNA 水平中表达差异的研究
• 4 小结
• 第四章 BDNF、NGF 对猪和牛早期胚胎发育的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 试验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 培养液中添加 BDNF 对牛 IVF 胚胎体外发育的影响
• 2.2 培养液中添加 BDNF 对牛 PA 胚胎体外发育的影响
• 2.3 培养液中添加 NGF 对牛 IVF 胚胎体外发育的影响
• 2.4 培养液中添加 NGF 对牛 PA 胚胎体外发育的影响
• 2.5 培养液中添加 BDNF 对猪 PA 胚胎体外发育的影响
• 2.6 培养液中添加 NGF 对猪 PA 胚胎体外发育的影响
• 2.7 培养液中添加 BDNF 对牛颗粒细胞体外生长的影响
• 2.8 培养液中添加 NGF 对牛颗粒细胞体外增生的影响
• 2.9 颗粒细胞生长情况分析
• 3 讨论
• 3.1 BDNF 与生殖系统的关系
• 3.2 NGF 与生殖系统的关系
• 3.3 颗粒细胞与胚胎发育的关系
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介