食品中新霉素兽药残留酶联免疫检测方法研究

论文摘要

本论文对兽药新霉素的酶联免疫分析方法进行了研究。采用碳化二亚胺法（EDC）将新霉素与匙孔血蓝蛋白（KLH）连接制得免疫原免疫兔子,制备出高效价和高特异性的新霉素多克隆抗体。采用碳化二亚胺法（EDC）与辣根过氧化物酶连接制得酶标抗原,建立了一种高灵敏度直接竞争ELISA检测方法,IC50为1.0±0.2μg/L,溶液中的最低检测限(IC15)为0.1±0.01μg/L,低于以往关于新霉素直接竞争ELISA分析方法的报道,并对方法的精密度进行了考察,板内变异和板间变异的变异系数均低于20%。由于新霉素在畜牧业生产中广为使用,因此在动物源性食品中残留较多,故将所建立的方法应用于所选取的牛奶、猪肉、鱼肉、鸡肉、鸡蛋和猪肾六种样品中新霉素残留的快速检测,详细考查了不同样品基质对ELISA方法的影响及其去除方法,新霉素的最低检出限均低于最低残留限量（500μg/kg或μg/L）,分别对新霉素在六种实际样品中的添加回收率进行实验,回收率平均可达到75%～105%,可满足国标检测方法对检测灵敏度的要求,也可满足快速筛选方法的要求。因为新霉素无发色团,在紫外和荧光条件下无法被检测到,故需采用衍生的方法。选择邻苯二甲醛和巯基乙醇对新霉素进行衍生,研究了衍生反应的试验条件,建立了检测动物源性样品中新霉素残留的高效液相色谱检测方法,采用液相色谱法对建立的新霉素直接竞争酶联免疫检测方法的准确性进行了验证。两种方法检测结果的一致性很高,线性相关系数R2值在0.9以上。进一步对新霉素抗体和酶标抗原的稳定性进行了研究,抗体和酶标抗原可在4℃条件下放置6个月以上保持检测性能基本不变,为进一步开发并研制快速检测新霉素残留试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 食品安全问题
• 1.2 兽药残留
• 1.2.1 兽药残留产生的原因
• 1.2.2 产生兽药残留的主要兽药种类
• 1.2.3 兽药残留的危害
• 1.2.4 兽药残留的国内外现状
• 1.3 快速免疫检测技术是食品安全监控的必然需求
• 1.4 氨基糖苷类抗生素简介
• 1.5 新霉素
• 1.5.1 新霉素简介
• 1.5.2 新霉素的药理学及药代动力学
• 1.5.3 新霉素在动物机体中的残留消除规律
• 1.5.4 新霉素的最高残留限量
• 1.5.5 新霉素残留的检测技术
• 1.6 酶联免疫吸附分析测定法简介
• 1.6.1 基本原理
• 1.6.2 完全抗原的制备
• 1.6.3 载体蛋白的选择
• 1.6.4 抗体的制备
• 1.6.5 抗体的纯化
• 1.6.6 酶联免疫吸附测定法的类型
• 1.6.7 ELISA的技术要点
• 1.6.8 实际样品ELISA分析的基质影响及其消除方法
• 1.6.9 ELISA的特点及应用
• 1.6.10 ELISA的分析参数及方法性能指标的评价
• 1.7 论文研究的目的及意义
• 1.8 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和试剂
• 2.1.2 仪器及材料
• 2.1.3 待测样品
• 2.1.4 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 人工免疫抗原的制备
• 2.2.2 包被抗原的制备
• 2.2.3 抗体的制备
• 2.2.4 酶标抗原的制备
• 2.2.5 间接竞争酶联免疫检测方法
• 2.2.6 直接竞争酶联免疫检测方法
• 2.2.7 样品处理方法
• 2.2.8 新霉素直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 2.2.9 仪器分析法确证
• 2.3 新霉素抗体和酶标抗原的稳定性实验
• 2.3.1 抗体稳定性实验
• 2.3.2 酶标抗原稳定性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 人工免疫原和包被原的制备
• 3.2 抗体的制备
• 3.2.1 抗血清效价的测定
• 3.2.2 抗体的纯化
• 3.2.3 抗体的特异性
• 3.3 新霉素间接竞争ELISA反应体系的考察和优化
• 3.3.1 包被原包被浓度的确定
• 3.3.2 标样稀释液离子强度的确定
• 3.3.3 标样稀释液pH值的确定
• 3.3.4 新霉素间接竞争ELISA标准曲线的建立
• 3.4 酶标抗原的制备及其浓度的优化
• 3.5 新霉素直接竞争ELISA反应体系的考察和优化
• 3.5.1 抗体包被浓度的确定
• 3.5.2 标样稀释液pH值的确定
• 3.5.3 标样稀释液离子强度的确定
• 3.5.4 新霉素直接竞争ELISA标准曲线的建立
• 3.6 样品基质对ELISA分析的影响及去除
• 3.7 六种动物源性食品中的样品检出限
• 3.8 加标回收试验结果
• 3.9 高效液相色谱法测定新霉素残留
• 3.9.1 检测波长的选择
• 3.9.2 流动相的选择
• 3.9.3 衍生液的反应比例
• 3.9.4 回归方程和线性范围
• 3.9.5 方法精密度
• 3.9.6 样品提取条件的选择
• 3.9.7 加标回收率分析
• 3.9.8 直接竞争ELISA检测结果与仪器分析结果的相关性
• 3.10 新霉素抗体和酶标抗原的稳定性实验
• 3.10.1 抗体稳定性实验
• 3.10.2 酶标抗原稳定性实验
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢