假单胞菌M18应答调控基因ppbR的克隆及功能研究

论文摘要

革兰氏阴性细菌存在着与菌群传感（Quorum Sensing）相关联的双元调控系统（two-component regulatory system）,双元系统参与调控细菌多种生命活动。根据铜绿假单胞菌基因组序列分析表明,铜绿假单胞菌中有64个应答调控子基因和63个组氨酸激酶基因,然而许多双元调控系统的生物功能仍然未知,目前只有少数例如GacA-GacS、PprA-PprB等双元系统有相关生物功能的文献报道,在假单胞菌中,GacA-GacS、PprA-PprB这两个调控系统参与调控菌群传感关联基因的表达和信号分子合成等细菌的生命活动。PA2572基因位于铜绿假单胞菌PAO1全基因组上,是根据其保守氨基酸基序、结构特征或者与其它已知功能的基因具有一定同源性而推测出其功能的基因,属于Ⅲ类基因（class3）,根据推测,PA2572编码蛋白可能是一个双元调控系统的应答调节子,通过蛋白比对结果表明PA2572编码蛋白是一个含有REC（CheY-like）结构域和HD-GYP结构域的应答调节子,并推测与细菌的运动力、次生代谢产物合成、蛋白质分泌以及与菌群传感（Quorum Sensing）系统相关联。但是所有这些功能只是通过同源性分析推测,并没有得到实验验证及相关报道。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 假单胞菌的生物防治机理
• 2. 双元组分调控系统
• 2.1 GacS/GacA 双元调控系统
• 2.1.1 RsmA 和RsmE
• 2.1.2 RsmY 和RsmZ
• 2.2 PprA/PprB 双元组分调控系统
• 3. 菌群传感系统（Quorum Sensing System）
• 3.1 革兰氏阴性细菌（G-）中感知种内数量的QS 系统
• 3.2 革兰氏阳性细菌（G+）中感知种内数量的QS 系统
• 4. 信号分子介导的基因调控
• 5. 泳动能力和群集运动能力
• 6. 假单胞菌株M18 在生物防治方面的应用
• 7. 研究目的、内容
• 7.1 研究的目的
• 7.2 研究的主要内容
• 第一章 假单胞菌M18ppbR 基因PCR 扩增及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验培养基、抗生素及菌株
• 1.2 假单胞菌M18 基因组DNA 的提取
• 1.3 引物和聚合酶链式（PCR）反应
• 1.4 电泳定性检验DNA
• 1.5 PCR DNA 片段的回收纯化及测序
• 1.6 序列比对及分析
• 2 结果
• 2.1 M18 基因组DNA 抽提结果及ppbR 基因片段PCR 结果
• 2.2 序列比对及分析结果
• 3 讨论
• 第二章 假单胞菌M18ppbR 基因的体外突变及突变株的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 实验用菌株及质粒
• 1.2 质粒DNA 抽提操作
• 1.3 酶切反应和DNA 片段回收
• 1.4 连接反应
• 1.5 感受态细胞制备
• 1.6 感受态细胞转化
• 1.7 细菌接合转移
• 1.8 突变株验证
• 2 结果
• 2.1 ppbR 基因的克隆
• 2.2 ppbR 基因的体外突变
• 2.3 ppbR 基因突变菌株M18P 的获得和验证
• 第三章 假单胞菌M18ppbR 基因对PCA 和Plt 区别性调控研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基及培养条件
• 1.3 生长曲线测定及PCA 和Plt 的提取和定量测定
• 1.4 β-半乳糖苷酶活性测定
• 1.5 过表达质粒pXU32P 构建
• 2 结果
• 2.1 PCA 和Plt 生物合成的动力学分析
• 2.2 β-半乳糖苷酶活性测定结果
• 2.3 在M18P 菌株中ppbR 基因过表达实验结果分析
• 3 讨论
• 第四章 假单胞菌M18ppbR 基因对信号分子产量的影响研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验用菌株
• 1.2 实验培养基及抗生素
• 1.3 菌株M18 发酵液中信号分子的提取
• 1.4 信号分子的生物检测
• 2 结果
• 2.1 信号分子生物检测结果
• 3 讨论
• 第五章 假单胞菌M18ppbR 基因对运动力的影响研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验培养基
• 1.2 泳动能力（ Swimming motility）的检测
• 1.3 群集运动能力（swarming motility）的检测
• 1.4 电镜观察
• 2 结果
• 2.1 运动力检测及电镜鞭毛观察结果
• 3 讨论
• 论文总结
• 参考文献
• 附录实验所用试剂及仪器设备
• 致谢
• 发表论文