苏云金芽胞杆菌新型cry1基因克隆、表达及活性分析

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种世界上应用广泛的生防微生物,它具有高度的杀虫特异性和对人畜无害的优点。主要的杀虫成份是杀虫晶体蛋白,由cry和cyt基因编码。其中cry1类基因的表达产物对多种鳞翅目害虫具有较高的杀虫活性,但是由于检测方法的局限性,快速、准确地鉴定已知和未知基因有一定的难度。为了充分发掘Bt菌株中cry1类基因资源,本研究建立了一个高分辨率的筛选cry1类基因的PCR - RFLP方法。通过生物信息学软件对cry1类模式基因进行聚类分析,根据全长基因的5’及3’端差异将cry1类基因分成4个大类,分别设计通用引物,酶切分析只需要区分一个大类中的几个基因,提高了分辨率。该方法可以快速、准确、有效地对Bt菌株中的cry1类基因进行分型,特别是可以检测出已知及新型的cry1类基因。通过原有的cry1类基因PCR - RFLP鉴定方法和新建立的体系对3株含有多种cry1类基因的Bt菌株进行了鉴定,发现原有体系在cry1类基因较多时无法准确检测,而且不能确定是否含有cry1I类基因,而新的体系对3株Bt菌株都达到了准确鉴定的目的,并且发现了一些国内还没有报道过的基因型,如cry1Hb、cry1Ja、cry1Ka、cry1La等。新体系不仅适用于单基因样品的分型,也适用于一株菌株中含有多个基因的样品的分型。应用新建立的平台对72株苏云金芽胞杆菌标准菌株和86株Bt野生菌株进行cry1类基因型的鉴定,发现标准菌株中有11株含有cry1类基因,而野生菌株中绝大部分都含有cry1类基因,从中选取了19个cry1新基因。另外根据Bt标准菌株T03B001的全基因组测序结果,发现了两个cry1新基因。根据这些基因的全长序列设计扩增cry1类基因的全长引物,成功克隆上述基因,除cry1Na外,20个cry1基因被国际Bt命名委员会正式命名为cry1Aa16、cry1Ab23、cry1Ab24、cry1Ah3、cry1Ai2、cry1Ba7、cry1Bb2、cry1Be4、cry1Ca12、cry1Da3、cry1Ea9、cry1Fa3、cry1Fa4、cry1Hb2、cry1Ia19、cry1Ib5、cry1Ie2、cry1Ja2、cry1Ka2、cry1La2。利用表达载体pEB在大肠杆菌Rosetta（DE3）中对这些基因进行表达,表达产物为60 - 130 kDa左右的蛋白。除Cry1Ka2和Cry1La2两种蛋白外,其它的Cry1蛋白都对敏感小菜蛾有毒力。没有活性报道的Cry1Hb蛋白对小菜蛾和棉铃虫都有毒力,LC50分别为305.82（241.66 - 391.76）μg/mL和315.12（225.68 - 456.86）μg/mL。Cry1Ba7和Cry1Ea9两种蛋白对大猿叶甲有较高的毒力,LC50分别为5.21（3.84 - 8.65）μg/mL和55.78（43.40 - 88.42）μg/mL,其中Cry1Ea对鞘翅目害虫的活性未见报道。Cry1Ca12对甜菜夜蛾有较高的毒力,LC50为89.11（60.54 - 121.26）×10-3μg/mL。Cry1Ie2和Cry1Na两种蛋白对亚洲玉米螟有较高的毒力,LC50分别为0.12（0.09 - 0.15）μg/mL和0.15（0.12 - 0.18）μg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌
• 1.2 杀虫晶体蛋白及其作用机理
• 1.2.1 杀虫晶体蛋白
• 1.2.2 杀虫晶体蛋白作用机制
• 1.2.3 杀虫晶体蛋白生物活性
• 1.3 杀虫蛋白的应用和害虫的抗性问题
• 1.3.1 杀虫蛋白的应用
• 1.3.2 害虫的抗性问题
• 1.4 苏云金芽胞杆菌cry 基因的分类和鉴定
• 1.4.1 cry 基因的分类
• 1.4.2 cry 基因的鉴定
• 1.5 Cry1 类杀虫蛋白的研究现状
• 1.6 本研究的立题依据和目的意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 供试昆虫
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 晶体形态观察
• 2.2.2 Bt 大质粒的提取
• 2.2.3 PCR 摸板的制备
• 2.2.4 PCR - RFLP 鉴定cry1 基因型
• 2.2.5 DNA 回收
• 2.2.6 连接反应
• 2.2.7 E. coli 感受态细胞制备
• 2.2.8 大肠杆菌转化
• 2.2.9 E. coli 质粒 DNA 提取
• 2.2.10 酶切体系
• 2.2.11 cry1 类全长基因的扩增、克隆及序列测定
• 2.2.12 新基因在大肠杆菌中表达研究
• 2.2.13 蛋白电泳检测
• 2.2.14 杀虫活性测定
• 3. 结果与分析
• 3.1 cry1 类基因 PCR – RFLP 鉴定体系的优化
• 3.1.1 原有鉴定体系鉴定3 株 Bt 野生型菌株
• 3.1.2 新鉴定引物设计
• 3.1.3 优化后体系鉴定3 株Bt 野生型菌株
• 3.2 应用优化后体系筛选cry1 类基因
• 3.2.1 72 株标准菌株cry1 类基因的鉴定
• 3.2.2 Bt 分离株cry1 类基因的鉴定
• 3.3 北京植物园Bt 菌株的分离鉴定
• 3.3.1 晶体扫描电镜图
• 3.3.2 菌株大质粒图谱分析
• 3.3.3 菌株蛋白图谱
• 3.3.4 菌株cry 基因型鉴定
• 3.3.5 菌株生物活性测定
• 3.4 cry1 类新基因全长的克隆及序列分析
• 3.4.1 PCR - RFLP 检测出的cry1 类基因的全长克隆及序列分析
• 3.4.2 T03B001 菌株中cry1 类新基因的全长克隆及序列分析
• 3.4.3 新型cry1 类基因的比较分析
• 3.5 cry1 类新基因异源表达
• 3.5.1 cry1 类新基因异源表达载体的构建
• 3.5.2 cry1 类新基因在大肠杆菌异源表达
• 3.6 Cry1 类新蛋白杀虫活性的研究
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文