糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化及虫草菌液对其影响

论文摘要

研究背景糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）的发病率逐年上升,已成为终末期肾病（End stage renal disease,ESRD）的主要原因。其重要病理改变就是肾小管间质病变。细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）在肾间质过量堆积是其基本病理特征。肾间质肌成纤维细胞（MyoF）是肾间质中产生ECM的主要细胞。在病理条件下,肾小管上皮细胞可发生上皮细胞—肌成纤维细胞转分化（TubularEpithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT）,即丧失原有的上皮细胞表型特征,而获得MyoF的新特征。有研究表明肾小管上皮细胞转分化是肾间质MyoF的重要来源之一,并可能在DN发生发展中起重要作用。深入研究其产生的机制,寻找有效的阻断TEMT的手段,具有重要意义。在TEMT过程中,转化生长因子-β1（TGF-β1）是重要的启动和促进因子。TGF-β1生物学作用广泛而复杂,具有正面和负面的多样效应。单纯抑制TGF-β1,则可能在抑制TEMT同时带来不利的副作用。寻找其下游作用更特异、有效的因子或环节,成为了新近研究的关注热点。整合素连接激酶（Integrin-linked kinase,ILK）是新近发现的一种与整合素细胞内区域结合的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。以往对ILK的研究主要集中在肾小球,近年在UUO模型大鼠和体外细胞培养的研究结果表明,肾间质ECM的聚积与ILK表达正相关;ILK介导TGF-β1/Smad信号传导通路,可能参与TEMT过程。然而,在DN肾小管上皮细胞中ILK表达情况及其与TEMT关系,目前所知尚少。既然TEMT在糖尿病肾病等慢性肾脏病的纤维化进程中发挥着重要促进作用,那么,如果能通过某些方法干扰或阻止肾小管上皮细胞的转分化过程,则有可能延缓或逆转肾间质纤维化的发生与发展。冬虫夏草作为我国传统中药中的瑰宝,其具有滋阴补肾的肾脏保护作用已为大量的临床实例所证实。冬虫夏草是否能阻抑TEMT,减轻肾间质纤维化从而发挥其肾保护作用?此种作用是否与ILK有关?尚未见相关报道。本研究拟采用人近端肾小管上皮细胞（HK-2）和糖尿病大鼠模型为研究对象,从体外细胞培养和动物体内实验两个实验层面,采用反映上皮细胞表型特征的E钙粘素（E-Cadherin）、反映MyoF表型特征的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和作为ECM成分的纤维连接蛋白（FN）等指标,观察在DN小管间质病变中,肾小管上皮细胞转分化与ILK表达的改变,以及TEMT与ILK的关系;并用虫草菌液干预处理,观察虫草菌液对上述过程的影响。旨在从TEMT这一新途径,深入探讨DN发病具体机制及冬虫夏草肾脏保护作用的可能新机制。方法（一）细胞实验部分应用细胞培养技术,按下列实验条件分组培养人近端肾小管上皮细胞（HK-2）:正常糖（含5.5mM D-葡萄糖）对照组（N组）;甘露醇（含24.5mM D-甘露醇+5.5mM D-葡萄糖）对照组（M组）;高糖（含30 mMD-葡萄糖）组（H组）;高糖+虫草菌液5μg/ml（H+5C组）;高糖+虫草菌液10μg/ml（H+10C组）;高糖+虫草菌液20μg/ml（H+20C组）。于48h收集各组细胞,免疫印迹方法检测E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK的蛋白表达。（二）动物实验部分雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（N组,n=12）、糖尿病模型组（D组,n=12）和糖尿病虫草菌液干预组（C组,n=12）。采用腹腔内一次注射STZ 55mg·kg-1诱导糖尿病模型。虫草菌液组大鼠于糖尿病成模后,给予虫草菌液1000mg·kg-1·d-1灌胃。分别于第8、16周末,每组随机选取6只大鼠,留24小时尿测定尿蛋白排泄量;处死大鼠,心脏取血测血清肌酐（SCr）、血甘油三酯（TG）和胆固醇（CH）;肾脏原位灌洗后,取肾组织:石蜡切片,HE和Masson染色观察肾小管间质损害及纤维化;免疫组化法检测肾小管上皮细胞E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK的表达;免疫印迹方法检测肾组织E-Cadherin、α-SMA、FN与ILK蛋白的表达。结果1.高糖环境下HK-2细胞H组与N组比较,E-Cadherin的蛋白表达减少（P＜0.05）;ILK、α-SMA、FN蛋白的表达增多（P＜0.05）。经虫草菌液处理后的各C组与H组比较E-Cadherin的蛋白表达上调（P＜0.05）,α-SMA、FN及ILK、蛋白表达下调（P＜0.05）,且与虫草菌液呈剂量依赖性关系（P＜0.05）。2.D组和C组糖尿病大鼠的尿蛋白排泄量、肾小管间质损伤指数及间质胶原相对面积等均随病程进展而增加,明显高于同期N组（P＜0.01）;虫草菌液（C组）能减轻上述病变。16周时C组较同期D组,其肾脏保护作用更显著（P＜0.05）。3.D组和C组糖尿病大鼠肾小管上皮细胞E-Cadherin表达随病程逐渐减少（P＜0.05）,而α-SMA、FN表达逐渐增加,均较同期N组有显著差异（P＜0.05,P＜0.01）;同时,ILK表达也明显上调（P＜0.05）。ILK与E-Cadherin呈负相关（rs=-0.81,P＜0.05）,与α-SMA、FN呈正相关（rs=0.84,P＜0.05;rs=0.93,P＜0.01;）。虫草菌液干预可改善上述变化,16周时C组较同期D组各指标的改善呈现显著差异（P＜0.01）。结论1.高糖环境下HK-2细胞与糖尿病大鼠肾小管上皮细胞E-cadherin表达减少,α-SMA、FN表达增加,表明在DN肾小管间质病变进程中,存在。肾小管上皮细胞转分化（TEMT）。2.在DN病理状态下,肾小管上皮细胞的ILK表达增高,且与TEMT过程高度相关;ILK参与、介导了DN的TEMT过程,在其中起着正向调控作用。3.虫菌液草可下调高糖环境下HK-2细胞ILK的表达,阻抑TEMT。4.虫草菌液能减轻DN肾小管间质病变,下调肾小管上皮细胞的ILK表达,阻抑TEMT,显示出抗纤维化作用。其可能是虫草菌液对DN肾保护作用的重要机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词表
• 前言
• 第一部分 虫草菌液对高糖环境下 HK-2细胞转分化的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第二部分 虫草菌液对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一 肾小管上皮细胞转分化与肾纤维化
• 综述二 冬虫夏草临床应用研究进展
• 致谢
• 攻读学位期间研究项目及成果