无胶筛分毛细管电泳检测基因突变的方法学研究

论文摘要

癌症的早期诊断对其治愈起着重要的作用。研究表明基因突变在癌症的发生中起着不可忽视的作用，基因突变的检测成为癌症早期诊断的重要手段。目前几乎所有的基因突变检测都是建立于PCR的基础之上，操作简便准确率高的基因分析技术——限制性片段长度多态性（RFLP）常与PCR技术结合用于基因突变的检测。PCR-RFLP检测基因突变的结果往往需要借助电泳技术显示。传统的平板凝胶电泳分辨率低、分析时间长，不能很好的用于各种长度DNA片段尤其是小DNA片段的多态性分析。无胶筛分毛细管电泳（NGS-CE）是一种新型电泳与色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少等特点，已经成为分离分析DNA片段的重要方法之一。筛分介质特性、筛分介质中的添加剂、电泳缓冲液的pH、电泳温度、电场强度、电渗流等参数都不同程度的影响NGS-CE分离DNA的效果，其中，筛分介质特性对NGS-CE分离DNA的影响最为显著。为了将NGS-CE更好地应用于癌症的早期诊断，本论文分成两部分对NGS-CE检测基因突变的方法进行系统的研究。第一部分主要研究了两种不同长度线性聚丙烯酰胺的合成及其对DNA的分离。在聚合反应中加入不同比例的链转移剂异丙醇得到分子链长度不同的两种线性聚丙烯酰胺（LPAⅠ和LPAⅡ），系统分析了两种LPA的物理特性及其分离DNA的差异。两种LPA具有不同的分子量、交缠临界浓度和旋转半径，但它们在相同的浓度下却具有相同的筛分孔径。两种LPA在最佳分离条件下均能成功分离PBR322／BsuRI DNA Marker中小于70bp DNA片段，且得到较高的分离度，另外，以LPAⅠ作为筛分介质得到较LPAⅡ更大的分离度，以LPAⅡ作为筛分介质需要较LPAⅠ更短的分析时间，它们都可用于临床和基础研究中小于70bp DNA片段的分析，在临床和基础研究中建立了一种快速、灵敏分析小于70bp DNA片段的方法。本文还尝试性地将两种LPA用于较大DNA片段的分离，它们在任何分离条件下均不能实现1Kb DNA Marker P中13条DNA片段的完全分离，最多只能得到11个色谱峰。第二部分主要是将以上建立的快速、灵敏分析小于70bp DNA片段的方法与PCR-RFLP技术相结合用于胃癌组织p53基因248位、249位密码子突变情况的同时检测。提取了59例胃癌患者的癌组织及癌旁正常组织的基因组DNA，经测定所提取的DNA浓度适中，纯度较好。利用PCR扩增p53基因上包含248位与249位密码子长度为200bp的DNA片段。使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，排除了PCR产物中离子和引物二聚体对后续研究的干扰。限制性内切酶MspⅠ和HaeⅢ同时切割纯化的PCR产物，然后以NGS-CE分离小于70bp DNA片段时获得最高分离度的电泳条件（筛分介质为8％LPAⅠ、添加剂甘露醇浓度为8％、pH为6.5、温度为15℃、电场强度为275V／cm）分析临床59例胃癌患者p53基因扩增产物的限制性片段长度多态性。30min内同时检测了p53基因中248位和249位两个密码子位点的突变情况，实现了35bp和40bp DNA片段的基线分离，且得到较高分离度（1.642）。初步建立了快速、高分辨率诊断胃癌的方法。本论文合成了两种不同长度的LPA，并分别以它们作为筛分介质考察分离DNA的差异，最终用于临床59例胃癌患者基因点突变的检测。在临床和基础研究中建立了快速、灵敏分析小片段DNA多态性的方法。另外，还初步建立了快速、高分辨率诊断胃癌的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 研究背景
• 第一节 胃癌组织中常见异常基因及其检测方法
• 1.1.1 胃癌组织中常见的异常基因
• 1.1.2 异常基因检测方法简介
• 第二节 NGS-CE技术研究进展
• 1.2.1 筛分介质
• 1.2.2 电渗流
• 1.2.3 添加剂
• 1.2.4 其它因素
• 第三节 NGS-CE在肿瘤相关基因研究中的应用
• 参考文献
• 第二章 两种不同长度线性聚丙烯酰胺的合成及其对DNA分离的研究
• 第一节 两种不同长度线性聚丙烯酰胺的合成及其对小片段DNA分离的研究
• 2.1.1 前言
• 2.1.2 实验部分
• 2.1.2.1 主要试剂及仪器设备
• 2.1.2.2 实验方法
• 2.1.3 结果与讨论
• V、C^*和R_g值'>2.1.3.1 两种LPA的[η]、M_V、C^*和R_g值
• b值'>2.1.3.2 不同浓度下两种LPA的ξ_b值
• 2.1.3.3 两种LPA分离小于70bp DNA片段时分离度的差异
• 2.1.3.4 两种LPA分离小于70bp DNA片段时迁移时间的差异
• 2.1.4 结论
• 第二节 两种不同长度线性聚丙烯酰胺的合成及其对大片段DNA分离的研究
• 2.2.1 前言
• 2.2.2 实验部分
• 2.2.2.1 主要试剂及仪器设备
• 2.2.2.2 实验方法
• 2.2.3 结果与讨论
• V、C^*和R_g值及其不同浓度下的ξ_b值'>2.2.3.1 两种LPA的[η]、M_V、C^*和R_g值及其不同浓度下的ξ_b值
• 2.2.3.2 两种LPA分离较大DNA片段的差异
• 2.2.4 结论
• 本章小结
• 参考文献
• 第三章 NGS-CE-RFLP快速检测胃癌组织中p53基因点突变
• 第一节 胃癌组织基因组DNA的提取及p53基因的PCR扩增
• 3.1.1 前言
• 3.1.2 实验部分
• 3.1.2.1 实验材料、主要试剂及仪器设备
• 3.1.2.2 实验方法
• 3.1.3 结果与讨论
• 3.1.3.1 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
• 3.1.3.2 OD值
• 3.1.3.3 PCR扩增结果
• 3.1.3.4 PCR扩增产物纯化结果
• 3.1.4 结论
• 第二节 NGS-CE-RFLP分析PCR产物
• 3.2.1 前言
• 3.2.2 实验部分
• 3.2.2.1 主要试剂及仪器设备
• 3.2.2.2 实验方法
• 3.2.3 结果与讨论
• 3.2.4 结论
• 本章小结
• 参考文献
• 论文总结
• 英文缩写的全称及中文名称
• 硕士期间发表的论文
• 硕士期间参与课题及完成内容
• 致谢