论文摘要
小麦是世界上最重要的粮食作物之一,但利用现代生物技术进行改良小麦品种则相对滞后,其瓶颈在于小麦组培技术尚不成熟。目前小麦转化中常用的受体是幼胚,但幼胚的获得受到季节制约,且发育状态不易控制,致使小麦的转化工作步履维艰。而成熟胚则具有取材方便、发育状态一致、不受季节限制等优点,但离体培养再生能力极低,难于应用于小麦的遗传转化。因此,进一步提高成熟胚的脱分化和再生能力并从基因表达水平上揭示分子机理具有重要意义。本研究以河南省生产上曾经推广的主要小麦品种豫麦18为材料,从外部形态、细胞结构及基因表达等不同层面对小麦成熟胚脱分化进行了研究。本文应用显微技术,观察小麦成熟胚脱分化中细胞的形态变化。结果表明,细胞脱分化的确切部位是主胚根的胚根鞘组织细胞;细胞脱分化形成愈伤组织的时间是诱导后24h。根据脱分化组织细胞变化的结果,我们将小麦成熟胚脱分化分为以下四个时期:第一阶段为信号传导期（Stage of signal Transduction,缩写为SST）,发生时间为0-2h,这个时期细胞接受生长素等信号刺激并传导至细胞内部;第二阶段为信号响应期（Stage of signal response,缩写为SSR）,发生时间为2-12h,这个时期内细胞对生长素信号刺激快速作出响应,细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核发生一系列生物学变化,从而导致细胞形态变化:第三阶段为细胞重塑期（Stage of cell remodification,缩写为SCR）,发生时间为12-24h,这个时期内细胞在前期响应的基础上发生内外结构的重新塑造,为细胞分裂作好准备;第四阶段为愈伤组织形成期（Stage of calli formation,缩写为SCF）,发生时间为24h及以后的时间,这个时期以愈伤组织形成为主。为研究小麦成熟胚脱分化分子机理,本研究利用Affymetrix wheat GeneChip?基因芯片技术在转录水平研究了内源生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯等5大类激素相关基因在小麦成熟胚脱分化中的表达变化。以小麦成熟胚脱分化起始0点为对照,分别研究0、2、6、12、24和72h时这些基因的表达变化,将那些与0点比值大于2或小于0.5,即表达变化两倍以上的基因视为有意义的基因,分析了这些发生有意义变化的激素相关基因在小麦成熟胚脱分化中的表达情况。结果表明,在含有61127个探针组,代表了55085个基因的小麦基因组表达谱上,发生有意义表达变化的基因共约有15000个,其中,这5大类激素相关基因有263个。分析表明,在小麦成熟胚脱分化中,生长素相关基因有114个,细胞分裂素相关基因有39个,它们大多表达上调,推测这些基因在脱分化中发挥重要作用;赤霉素相关基因有31个,上调和下调的基因数基本相同;脱落酸相关基因有64个,乙烯相关基因有15个,它们多半表达下调,推测它们在脱分化中几乎不起作用。由于质膜H+-ATPase（PM H+-ATPase）在小麦成熟胚脱分化中具有重要作用,本研究根据GenBank中已注册的小麦PM H+-ATPase cDNA序列（注册号:AY543630）,对质膜H+-ATPase基因同时进行了基因芯片检测和Real Time PCR检测。其中,质膜H+-ATPase基因芯片检测表明,在2和6h的杂交信号较强;Real Time PCR结果表明,在2和6h的基因拷贝数较多。可见,质膜H+-ATPase的基因芯片结果与Real Time PCR结果比较一致,并且它在整个脱分化过程中均表达上调,推测质膜H+-ATPase是参与小麦成熟胚脱分化的重要酶类之一,在脱分化中6h作用最强。