牛白细胞介素32基因β、γ亚型的分子克隆与功能验证

论文摘要

结核病是一种由结核分支杆菌感染而引发的慢性肉芽肿性炎症。该病属人畜共患疾病，病原菌一旦侵染可感染人畜全身多个器官，危害极大。近年来，结核病的发病率在全球范围内一直呈上升趋势，特别是牛结核疫情的加重不仅威胁动物群体健康，更加威胁人类身体健康，因此生产转基因抗结核牛具有重大意义。目前国内转基因动物技术已达到一定水平，但选择合适的用于转基因动物的基因仍不多。本研究克隆的牛白细胞介素32（Interleukin-32，IL-32）基因是近年发现的一种新型功能基因，其主要作用是诱导其他细胞因子和化学因子的产生，并在自身免疫性炎症性疾病中发挥重要作用。目前已经发现IL-32具有抑制结核分支杆菌（Mycobacterium）等多种分支杆菌感染，提高动物机体抗病能力的作用。结核分枝杆菌可以从人类单核细胞和巨噬细胞中通过半胱天冬酶-1/IL-18/Interferon-γ-依赖机制诱导IL-32的产生，在人巨噬细胞中，IL-32的高表达，可显著降低宿主细胞内结核杆菌的存活率。本研究分析了牛IL-32β在秦川牛不同组织中的表达情况，牛IL-32β在秦川体内主要分布于脾脏和肾脏，其他组织目前尚未发现。并从秦川牛脾脏中分子克隆了牛IL-32β基因的可变剪接体牛IL-32γ基因，序列分析表明，牛IL-32γ比牛IL-32β序列多了第二个内含子，从而导致编码序列多编码47个氨基酸。构建牛IL-32γ的原核表达载体，并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出该蛋白，摸索蛋白表达条件，IPTG浓度为1mg/mL，温度为28℃时，表达效果较好。成功的表达该目的蛋白为制备多克隆抗体打下了一定基础。为制备其单克隆抗体提供参考。为了进一步研究该可变剪接体的功能，本研究构建了真核表达载体pIRES-IL32γ-GFP，将该载体稳定转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7，得到超表达牛IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞系，同时以稳定转染人IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞为阳性对照，Real-time PCR检测表明，超表达IL-32γ的细胞具有调节IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子表达的功能，其趋势与阳性对照人IL-32γ的趋势相近。。本研究为进一步研究牛IL-32γ基因生物学功能提供了重要依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 白细胞介素 32 基因研究进展
• 1.1 IL-32 的生物学特性
• 1.1.1 IL-32 的来源
• 1.1.2 IL-32 的亚型
• 1.2 IL-32 的生物学功能
• 1.2.1 IL-32 诱导细胞因子产生炎症反应
• 1.2.2 IL-32 介导 T 细胞凋亡
• 1.3 IL-32 的受体及信号转导
• 1.4 IL-32 与疾病发生
• 1.4.1 IL-32 与类风湿关节炎
• 1.4.2 IL-32 与克罗恩病
• 1.4.3 IL-32 与癌症
• 1.4.4 IL-32 与流感
• 1.4.5 IL-32 基因与结核菌
• 试验研究
• 第二章 牛白细胞介素 32 基因Β、Γ亚型的序列分析与分子克隆
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验用组织、工程菌及载体
• 2.1.2 试验用主要试剂及工具酶
• 2.1.3 试验用主要仪器与设备
• 2.1.4 主要试剂配方
• 2.1.5 分子生物学与生物信息学软件、数据库、网站
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 数据库中牛白细胞介素 32 基因的序列比对
• 2.2.2 牛白细胞介素 32 基因的分子克隆
• 2.2.3 牛 IL-32β的组织表达特异性分析
• 2.2.4 牛 IL-32 基因生物信息学预测与分析
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 牛白细胞介素 32 基因的序列分析
• 2.3.2 牛白细胞介素 32 基因的分子克隆
• 2.3.3 牛 IL-32β的组织特异性表达
• 2.3.4 牛 IL-32 基因生物信息学分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 牛白细胞介素 32 基因的原核表达
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 试验用工程菌及载体
• 3.1.2 试验用主要试剂及工具酶
• 3.1.3 试验用主要仪器与设备
• 3.1.4 主要试剂配方
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 白细胞介素 32 基因的原核表达载体的构建
• 3.2.2 白细胞介素 32 基因在大肠杆菌 BL21（DE3）菌体中的原核表达
• 3.2.3 SDS-PAGE 检测 IL-32γ基因的表达
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 原核表达载体的构建及酶切鉴定
• 3.3.2 SDS-PAGE 检测 IL-32 基因的表达
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 牛白细胞介素 32 基因的真核表达及稳转细胞系的筛选
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 试验用材料、工程菌、细胞及载体
• 4.1.2 试验用主要试剂及工具酶
• 4.1.3 试验用主要仪器与设备
• 4.1.4 主要试剂配方
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 白细胞介素 32 基因的真核表达载体的构建
• 4.2.2 真核表达载体的细胞水平验证
• 4.2.3 pIRES-IL32γ-GFP 稳定转染小鼠巨噬细胞 RAW264.7
• 4.3 试验结果
• 4.3.1 真核表达载体的构建及酶切鉴定
• 4.3.2 在巨噬细胞中表达 IL-32
• 4.3.3 建立牛和人 IL32γ-GFP 稳转小鼠巨噬细胞系
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 牛白细胞介素 32 基因的功能验证
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 试验用主要试剂及工具酶
• 5.1.2 试验用主要仪器与设备
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 引物设计与合成
• 5.2.2 半定量 PCR 检测瞬转 IL-32 基因的小鼠 RAW264.7 巨噬细胞的免疫细胞因子表达情况
• 5.2.3 实时定量 PCR 检测稳定转染 IL-32 基因的小鼠 RAW264.7 巨噬细胞的免疫细胞因子表达情况
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 半定量 PCR 检测瞬转 IL-32 基因的小鼠 RAW264.7 巨噬细胞的免疫细胞因子表达情况
• 5.3.2 实时定量 PCR 检测稳定转染 IL-32 基因的小鼠 RAW264.7 巨噬细胞的免疫细胞因子表达
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简介