论文摘要
目的在第一部分中建立阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）模式间歇低氧（IH）／再氧合（ROX）气体环境模型，而后，应用这一模型探讨①OSAHS模式IH以及持续低氧（CH）暴露时内皮细胞培养基中炎性分泌蛋白的变化[白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNFα）]（研究1），②内皮细胞转录因子和细胞表面炎性蛋白的变化[核因子κB（NF-κB）和细胞间黏附分子1（ICAM-1）]（研究2）以及③内皮细胞转录因子的核内转位情况[核因子κB（NF-κB）]（研究3）。在第二部分中阐述不同间歇低氧（IH）程度、IH时间和再氧合（ROX）时间以及持续低氧（CH）模式家兔在体颈动脉体（CB）和颈总动脉在体模型建立过程。而后，应用该模型探讨①IH时家兔颈总动脉内皮炎症状态及其与瘦素的相互关系（研究1）；并探讨②不同频率IH/ROX暴露后家兔CB的氧化应激、炎症状态、内皮素水平和CB窦神经（CSN）的传入活性（研究2）。材料与方法第一部分中由计算机程序在细胞培养舱中产生相应的IH或CH暴露条件，将人脐静脉内皮细胞可传代细胞株ECV304暴露于该条件。①在研究1中，将暴露细胞株分为间歇正常氧（IN）组，IH组，IH高碳酸组，CH组，CH高碳酸组，CH累加IH组，不同IH程度组，不同IH频率组和不同IH时限组。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养基中IL-6和TNFα的水平。②在研究2中，将ECV304细胞株暴露于IH／ROX环境60次循环。暴露时按IH／ROX时段将细胞分为11组，每组样本数为12。A组：采用21％O2 15 s／21％O2 3 min 45 s方案（即间歇正常氧）；B组：置于标准孵箱中不加暴露（标准孵育）；C组：采用1．5％O215s／21％O2 3 min 45 s方案；D组：采用10％O2 15 s／21％O2 3 min 45 s方案；以下固定IH方案为1．5％O215s和ROX程度21％O2不变，IH／ROX循环频率分别为每小时12次（即为C组）、9．23次（E组）、6．32次（F组）、20次（G组）和40次（H组）；I组：采用1．5％0O30 s／21％O2 3 min 45 s方案；C组完成暴露后放回标准孵箱中60 min为J组而120 min为K组。采用ELISA法和细胞表面ELISA法测定细胞裂解液中总NF-κB水平和细胞表面ICAM-1浓度。③在研究3中，暴露细胞株分为7组，每组样本数n=12，分别为IN组；IH组，CH组（15 min和30 min两个组）；CH累加IH组；IH恢复组；CH恢复组。ELISA法测定细胞中核内外NF-κB水平。第二部分中成年雄性新西兰大耳白家兔（2．5-3．0 kg）游离右侧颈总动脉和CSN，显露CSN化学感受性神经细束并安放电极记录CSN传入活性。结扎右侧颈总动脉向心端血流，并向右侧颈总动脉远心端内插入导管，经蠕动输液泵交替灌注以发泡法预平衡IH／CH灌注液。监测CSN传入活性，完成暴露后游离收集CB和插管远心端的颈总动脉及其分叉。①研究1中，将60只家兔分为六组，每组10只，分为A．间歇正常氧（IN）组；B．重度IH组；C．轻度IH组；D．重度IH+瘦素组；E．CH组；F．单纯瘦素培养组（Lep组）。暴露后剪下远端颈总动脉，纵向剖开刮取内皮细胞层。标本一部分以非放射性凝胶迁移实验测定IN组、重度IH组、轻度IH组和CH组核抽提物中核转录因子κB（NFκB）DNA结合活性。IN组、重度IH组、重度IH+Lep组和Lep组的另一部分于标准孵箱培养2小时，培养时在重度IH+Lep组和Lep组培养孔中加入人重组瘦素（终浓度10 ng／ml）。以ELISA法测定培养基中白细胞介素-6（IL-6）浓度。以逆转录．聚合酶链反应测定内皮细胞Ras同源物A（RhoA）mRNA表达水平。②研究2中，将49只家兔分为7组，每组7只，分为A．间歇正常氧（IN）组；B．IH／ROX频率为10次／小时组(10·hr-1组)；C．IH／ROX频率为30次／小时组(30·hr-1组)；D．IH／ROX频率为50次／小时组(50·hr-1组)；E．IH／ROX频率为60次／小时组(60·hr-1组)；F．IH／ROX频率为90次／小时组(90·hr-1组)；G持续低氧组（CH组）。暴露完成后采集CSN化学感受性神经细束传入活性的频率（Charge F），而后游离收集右侧CB，以ELISA法测定CB裂解液中白细胞介素-6（IL-6）、内皮素-1（ET-1）、低氧诱导因子-1（HIF-1）和血管内皮生长因子（VEGF）的浓度并标化。所有研究均用SPSS统计软件包统计学分析。结果第一部分①研究1中，IN组IL-6和TNFα水平为（374．06±38．10）和（31．96±13．64）pg·ml-1·100mg蛋白-1，而IH组2的IL-6和TNFα水平为（770．40±21．60）和（126．93±2．58）pg·ml-1·100mg蛋白-1，明显高于IN组（均U=0．000，P=0．002）；IH高碳酸组IL-6水平为（829．27±7．16）pg·ml-1·100mg蛋白-1，高于IH组2（U=0．000，P=0．002）。CH高碳酸组的IL-6均明显高于相同经时反应进程的CH组（均U=0．000，P=0．002），CH累加IH组IL-6和TNFα水平为（536．74±14．97）和（51．10±6．80）pg·ml-1·100mg蛋白-1，高于IN组却低于IH组2（均χ2=23．4，P<0．05）。IL-6和TNFα水平随IH程度加重而增加（均χ2=23．4，P<0．05），不同IH频率组的IL-6和TNFα水平则呈现出复杂变化。②在研究2中，C组NF-κ3和ICAM-1水平分别为（0．8218±0．2760）、（1561．86±55．81）pg／ml，A组分别为（0．3668±0．0743）、（768．11±79．46）pg／ml，两组比较差异有统计学意义（分别为D=225，P<0．01和D=176．04，P<0．05）；D组分别为（0．6574±0．2207）、（1112．81±75．99）pg／ml，与C组比较差异有统计学意义（分别为U=25．000和U=0．000，P均<0．01）；Ⅰ组分别为（0．4450±0．1621）、（1154．88±19．00）pg／ml，C组与Ⅰ组比较差异有统计学意义（分别为U=27．000和U=0．000，P均<0．01）；同时，C组在不同IH频率各组的比较中NF-κB和ICAM-1水平办是相对最高的（χ2分别为35．632和56．893，P均<0．01）；J组NF-κB水平[（0．6233±0．0534）]与C组比较差异无统计学意义（D=36，P>0．05），而K组的NF-κB水平[（0．3050±0．0013）]与C组比较差异有统计学意义（D=234，P<0．01）。③在研究3中，IH组核内NFκB的光密度标化（间歇正常氧组％）水平（6．2980±0．2754）明显高于低氧累计时间和程度相同的CH组（1．1680±0．3626）；无论核内NFκB水平还是培基IL-6浓度，CH累加IH组均低于IH组[分别为（3．5077±0．3497）vs．（6．2980±0．2754）和（536．74±14．28）vs．（770．40±20．59）pg／ml／100 mg蛋白]；经过120 min恢复，IH组核内NFκB仍未恢复至对照组水平[（2．7683±0．3968）vs．（1．0000±0．4855）]，而CH组核内NFκB水平始终没有明显变化[（1．1680±0．3626）vs．（1．0000±0．4855）]；胞浆NFκB水平在各组间无差异。第二部分①研究1中，各组NFκB DNA结合活性差异明显（F=112．428，P<0．001）；重度IH组该活性（4．27±0．64）高于轻度IH组（2．33±0．45）（标准误=0．2481，P<0．001）、IN组（1．00±0．26）（标准误=0．2191，P<0．001）和CH组（1．15±0．36）（标准误=0．2329，P<0．001）。各组RhoA mRNA表达水平差异明显（F=26．634，P<0．001）；重度IH+Lep组该表达（2．54±0．53）高于重度IH组（1．57±0．44）（标准误=0．21 83，P=0．002）、IN组（1．00±0．31）（标准误=0．1937，P<0．001）和Lep组（1.31±0．30）（标准误=0．1930，P<0．001）。各组培基IL-6浓度差异明显（F=79．922，P<0．001）；重度IH+Lep组IL-6浓度（1591．50±179．57 pg／ml）高于重度IH组（121 7．20±320．62pg／ml）（标准误=0．3572，P=0．036）、IN组（325．40±85．26 pg／ml）（标准误=0．1931，P<0．001）和Lep组（517．40±183．09 pg／ml）（标准误=0．2491，P<0．001）。②研究2中，IL-6、ET-1和Charge F的整体均数呈现出先升后降的趋势，50·hr-1组的IL-6、ET-1和Charge F水平均高于其余各组(与IN组、10·hr-1组、30·hr-1组、60·hr-1组、90·hr-1组和CH组相比较，标准误和P值分别为：IL-6：5．582、7．760、6．396、6．636、7．748和7．066，P均<0．001；ET-1：1．445、1．637、1．771、1．771、1．710和1．692，P均<0．00 1；Charge F：0．006788、0．008099、0．006819、0．007601、0．006732和0．008433，P均<0．001。)，且Charge F与IL-6和ET-1良好相关（与IL-6：r=0．736，P<0．01；与ET-1：r=0．757，P<0．01，Spearman’s等级相关。）。HIF-1水平逐渐增加，CH组HIF-1水平是最高的(与IN组、10·hr-1组、30·hr-1组、50·hr-1组、60·hr-1组和90·hr-1组相比较，标准误和P值分别为：7．173、7．127、7．179、7．629、8．923和8．481，P均<0．001。)。CH组VEGF水平增加最为明显(与IN组、10·hr-1组、30·hr-1组、50·hr-1组、60·hr-1组和90·hr-1组相比较，标准误和P值分别为：9．630、10．081、10．512、9．783、10．318和11．773，P均<0．001。)。结论第一部分结论为IH／ROX可对内皮细胞造成具有程度依赖性的炎性损伤，其损伤程度明显强于CH且不易恢复，即使IH暴露结束以后，炎症反应的基础在相当长时间内仍持续存在，这种IH／ROX损伤在伴有高碳酸暴露时程度更加严重；IH／ROX对内皮细胞的炎性损伤来源于ROX时段而非来源于IH时段，是ROX时相而非IH时相导致NFκB总含量增加且核内转位，诱导炎症产生；中度频率的IH／ROX将选择性激活细胞炎性通道，而过高频率和过长时段的IH反而激活细胞适应性通道。第二部分结论为IH／ROX明显激活内皮炎性通道，其作用强于CH且存在程度依赖性。当IH／ROX与瘦素共同暴露时有协同作用，炎症反应更加明显，并使内皮层通透性增加。IH／ROX暴露后CB CSN传入活性明显增强并与CB炎症和血管收缩密切相关，CB的炎症来源于ROX时段而非来源于IH时段。这种反应将导致高交感神经张力，在高血压发病中将起至关重要的作用。这一过程受到IH／ROX频率的影响。随着IH／ROX频率的不断增加，CB炎症状念、内皮素水平和CSN长期易化先是逐渐增加，而后再逐渐下降。而HIF-1和VEGF是IH／ROX的适应性通道成员。
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