树舌灵芝发酵条件的优化及发酵产物抑菌活性的研究

论文摘要

树舌灵芝在分类上隶属于担子菌门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属,是药食同源的大型高等真菌。研究表明树舌灵芝味苦,具有抗癌、止痛、消炎解毒等药理药效的作用。树舌灵芝成为当前名贵真菌的开发的热点,而且市场需求量与日俱增。本论文对在广西乐业天坑发现的野生树舌灵芝的液体发酵条件,固体发酵条件和固体发酵菌质多糖提取工艺以及固体发酵、液体发酵产物的抑菌活性和液体深层发酵的发酵液化学成分进行了研究。论文主要的研究内容及结果如下：1.经过实地考察,在广西乐业天坑腐木上采到一株野生树舌灵芝子实体,采用组织分离法、纯化得到树舌灵芝菌种,通过形态学观察方法并参考文献资料对其鉴定为树舌灵芝。2.以菌丝体生物量为考察指标,通过单因素的方法研究了培养基碳氮源、无机盐营养因素和发酵工艺条件等影响因素。确定了液体发酵产菌丝体培养基和发酵工艺条件为：玉米粉40 g/L,黄豆粉15g/L, KH2PO43g/L, MgSO4 1.5g/L,VB1 20 mg/L。初始pH 6,装液量80 mL/250 mL,接种量4%（体积分数）,于28℃下培养6 d,转速150 r/min,所接种的种子培养液培养时间为6 d。在优化的培养基和发酵工艺下,菌丝体生物量干重达到12.2 g/L。3.以发酵液胞外多糖为考察指标,通过单因素的方法开展了所需碳源、氮源的筛选的营养需求试验,并在此基础上进一步确定了发酵液胞外多糖的培养条件。结果表明,液体发酵产胞外多糖培养基配方：蔗糖50 g/L,黄豆粉10 g/L,KH2PO4 4.5 g/L, MgSO41.5 g/L, VB1 30 mg/Lo优化的培养条件为：初始pH值为6,每瓶添加15颗玻璃珠,装液量100 mL/250 mL,接种量5%,28℃下培养9d,转速150 r/min,所接种的种子培养液培养时间为6 d。在优化的培养基和发酵工艺条件下树舌灵芝发酵液胞外多糖产量可达到3.4 g/L。4.考察了固态发酵的发酵基质、碳源、氮源、VB1等因素对该菌株灵芝多糖生物合成的影响。以树舌灵芝多糖为评价指标,通过单因素实验优化树舌灵芝产多糖的固态发酵培养基。固态发酵培养基的组成为：稻壳和麦麸的质量比为2:1、蔗糖25 g/kg、黄豆粉5 g/kg、CaCl2 4.8 g/kg、KH2PO4 5g/kg、MgSO4·7H2O 5g/kg、VB120mg/kg。并在此基础上,以树舌灵芝多糖产量为评价指标,采用单因素试验确定了树舌灵芝发酵工艺条件。结果如下：接种量（v/w）为15%,初始pH值为6,培养基含水率为60%,28℃下培养15 d。在优化的固体发酵培养基和发酵工艺条件下树舌灵芝固体发酵菌质多糖产量可达到6.46 g/kg。5.以优化的固体发酵培养基和发酵条件下对树舌灵芝进行固体发酵培养,采用热水浸提法提取水溶性多糖,对树舌灵芝固体发酵菌质多糖的提取工艺进行了研究,通过单因素实验考察了料水比、提取温度、提取次数、提取时间4个因素对多糖提取的影响。实验结果表明树舌灵芝固体发酵菌质的提取条件为：料液比为1：30（g/mL）,提取温度为75℃,提取时间为2.5 h,提取次数为2次。优化多糖提取工艺后,每千克培养基（干重）经固体发酵培养后可得到7.51 g菌质多糖,比未经提取条件优化的多糖得率提高了16.3%。6.采用纸片扩散法比较了液体发酵菌丝体和发酵液石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取物和水相部分,发酵液胞外多糖和固体发酵多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等十种指示菌的的抑菌能力,结果表明采用不同的萃取剂所得的萃取物的抑菌效果不同。其中菌丝体和发酵液的氯仿、乙酸乙酯萃取物部分的抑菌效果显著。发酵液乙酸乙酯部分抑菌效果最好,对各个指示菌都有一定的抑菌效果,平均抑菌圈为19.6 mm；对发酵液乙酸乙酯部分进行梯度洗脱得到的9个组分的抑菌性做了进一步研究表明,其中石油醚洗脱体系乙酸乙酯和石油醚的体积比为30%所得到的组分（B5）抑菌效果最好,对真菌类指示菌的抑菌活性明显提高。用二倍稀释法检测发酵液30%乙酸乙酯部分对十种指示菌的最低抑菌浓度,藤黄微球菌的MIC为25mg/mL,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌的MIC为50 mg/mL,白色念珠球菌的MIC为100 mg/mL,酵母菌的MIC为200 mg/mL,对黑曲霉、米曲霉和木霉的MIC为400 mg/mL。7.对树舌灵芝发酵液化学成分进行了研究,分离纯化得到一个化合物：β-谷甾醇。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 我国野生树舌灵芝的分布情况
• 1.3 药理作用
• 1.3.1 免疫调节
• 1.3.2 抗氧化
• 1.3.3 抗肿瘤
• 1.3.4 抗病毒
• 1.3.5 抗菌消炎
• 1.3.6 护肝
• 1.3.7 其他作用
• 1.3.8 树舌灵芝的毒性
• 1.4 发酵条件对树舌灵芝三萜、多糖等目标产物的影响
• 1.4.1 营养因子对目标产物的影响
• 1.4.2 非营养因子对目标产物的影响
• 1.5 研究目的与意义
• 参考文献
• 第2章 树舌灵芝的分离鉴定及液体发酵的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器设备
• 2.2.4 培养基
• 2.3 方法
• 2.3.1 菌种分离
• 2.3.2 菌种纯化
• 2.3.3 菌种活化
• 2.3.4 液体菌种制备
• 2.3.6 菌丝体干重的测定
• 2.3.7 胞外多糖的测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 树舌灵芝的鉴定
• 2.4.2 液体发酵培养基的确定
• 2.4.3 液体发酵条件的优化
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第3章 树舌灵芝固态发酵条件的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 原料
• 3.2.3 固态发酵基础培养基
• 3.3 方法
• 3.3.1 菌种活化
• 3.3.2 液体菌种制备
• 3.3.3 固体发酵培养方法
• 3.3.4 固态发酵菌质多糖的提取和测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 固态发酵培养基的优化
• 3.4.2 固态发酵培养条件的研究
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第4章 固态发酵树舌灵芝菌质水溶性多糖的提取工艺的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.3 方法
• 4.3.1 菌种活化
• 4.3.2 液体菌种制备
• 4.3.3 固态发酵培养
• 4.3.4 固体发酵菌质多糖的测定
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 固液比的确定
• 4.4.2 提取时间的确定
• 4.4.3 浸提温度选择实验
• 4.4.4 提取次数选择实验
• 4.5 小结
• 参考文献
• 第5章 树舌灵芝发酵产物抑菌活性的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料
• 5.2.1 供试菌种
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要仪器设备
• 5.2.4 培养基
• 5.3 方法
• 5.3.1 菌种活化
• 5.3.2 液体菌种制备
• 5.3.3 液体发酵培养
• 5.3.4 固态发酵培养
• 5.3.5 抑菌活性物质的制备
• 5.3.6 树舌灵芝活性物质抑菌作用的方法
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 树舌灵芝菌丝体粗提物的抑菌效果
• 5.4.2 树舌灵芝发酵液粗提物的抑菌效果
• 5.4.3 树舌灵芝发酵液乙酸乙酯萃取物各组份抑菌活性
• 5.4.4 最低抑菌浓度的确定
• 5.5 小结
• 参考文献
• 第6章 树舌灵芝发酵液乙酸乙酯萃取物化学成分的研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料
• 6.2.1 仪器
• 6.2.2 试剂
• 6.3 方法
• 6.3.1 菌种活化
• 6.3.2 液体菌种制备
• 6.3.3 液体发酵培养
• 6.3.4 树舌灵芝发酵液乙酸乙酯萃取物的制备
• 6.3.5 乙酸乙酯萃取部分分离流程
• 6.4 结果与讨论
• 参考文献
• 第7章 结论
• 攻读硕士学位期间已发表的论文
• 致谢