纤维素酶系酿酒酵母载体的构建以及Pichia pastoris工程菌表达纤维素酶

论文摘要

乙醇是当前正在大力推广应用的可再生能源之一。纤维素质物质是地球上最大量可再生的生物质资源。纤维素质物质中的纤维素在纤维素酶的作用分解成葡萄糖,而葡萄糖可以通过发酵酿造酒精。纤维素酶是一类复合酶,含有三个主要组分。葡聚糖内切酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC 3 .2.1.4,简称EG）,也称为Cx酶或CMCase。葡聚糖外切酶（exo-1,4 -β-D-glucanase,EC3 .2.1.91）又称C1酶。C1酶作用于纤维素线状分子末端,水解β-1, 4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子,故又称纤维二糖水解酶（简称CBH）。以及β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase, EC 3.2.1.21,简称BG）。本实验通过外显子拼接法从由中科院微生物研究所菌种保存中心购买的里氏木霉QM9414（Trichoderma sp.）的基因组DNA中分别克隆到纤维素酶组分的三个基因:葡聚糖内切酶Ⅱ基因（eg2）、葡聚糖外切酶Ⅱ基因（cbh2）和β-葡萄糖苷酶Ⅰ基因（bg1）。并成功的克隆到E.coli DH5α中扩增。将克隆到的基因分别连接到到甲醇毕赤酵母Pichia pastoris的YIP型表达载体pPIC9K上,构建了三个诱导型表达载体pPIC9K-BG、pPIC9K-CBH和pPIC9K-EG。将pPIC9K的AOX1启动子替换成强组成型GAP启动子构建成pGAP9K载体,并将三个基因分别连接到pGAP9K上,构建了三个组成型表达载体pGAP9K-BG、pGAP9K- CBH和pGAP9K- EG。利用电转化技术将重组表达载体pPIC9K-CBH和pGAP9K-CBH转化毕赤酵母GS115,经G418抗生素筛选得到阳性菌株GS115（pPIC9K-CBH）和GS115（pGAP9K- CBH）。在生物反应器中发酵GS115（pGAP9K- CBH）,分泌表达重组CBHⅡ酶50mg/L。用CMC酶活法,测定其CMC酶活力为2.045U/mL。本实验还通过一系列的载体改造,将Invitrogen公司提供的pSP72克隆载体改造成为了一个含有三个纤维素酶基因表达盒的载体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 利用纤维素质原料生产乙醇
• 1.1.1 利用纤维素质原料生成乙醇的原理
• 1.1.2 纤维素酶
• 1.1.2.1 纤维素酶降解机理
• 1.1.2.2 产纤维素酶菌株的研究进展
• 1.1.2.3 纤维素酶基因的克隆
• 1.1.2.4 重组纤维素酶的表达
• 1.1.2.5 纤维素酶的活力测定
• 1.1.2.6 纤维素酶的用途
• 1.1.3 利用纤维素质材料酿造乙醇的工艺研究
• 1.1.3.1 纤维素质材料的物质组成
• 1.1.3.2 纤维素质物质材料的预处理
• 1.1.3.3 酶解
• 1.1.3.4 发酵工艺研究
• 1.2 PICHIA PASTORIS 表达系统
• 1.2.1 毕赤酵母表达系统的优特点
• AOX1表达系统'>1.2.2 P_AOX1表达系统
• GAP表达系统'>1.2.3 P_GAP表达系统
• 1.3 本研究的意义
• 1.4 本研究技术路线
• 1.4.1 Pichia pastoris 工程菌表达纤维素酶的技术路线
• 1.4.2 纤维素酶系酿酒酵母载体构建的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 分子生物学常用酶和试剂（盒）
• 2.1.3 常用培养基、试剂和缓冲液
• 2.1.3.1 常用培养基配方
• 2.1.3.2 常用试剂配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA 提取
• 2.2.1.1 质粒DNA 的提取
• 2.2.1.2 木霉基因组DNA 的提取
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.2.1 扩增纤维素酶基因的引物
• 2.2.2.2 扩增多克隆位点的引物
• 2.2.2.3 扩增 G418 抗性基因的引物
• 2.2.2.4 扩增酿酒酵母rDNA 基因的引物
• 2.2.3 PCR 反应
• 2.2.3.1 PCR 反应体系
• 2.2.3.2 PCR 反应条件
• 2.2.3.3 PCR 反应产物的检测
• 2.2.4 PCR 产物及质粒DNA 酶切反应
• 2.2.4.1 PCR 产物的沉淀回收
• 2.2.4.2 PCR 产物及质粒DNA 的单酶切
• 2.2.4.3 PCR 产物及质粒DNA 的双酶切
• 2.2.5 DNA 酶切产物的回收
• 2.2.6 DNA 分子的连接
• 2.2.6.1 PCR 回收产物与T 载体连接
• 2.2.6.2 目的片段与载体酶切后的连接
• 2.2.7 连接产物转化E.coli DH5α
• 2.2.7.1 E. coliDH5α感受态细胞的制备
• 2.2.7.2 连接产物转化
• 2.2.8 重组质粒的提取
• 2.2.9 重组子的酶切鉴定
• 2.2.10 阳性克隆的测序
• 2.2.11 酵母转化
• 2.2.11.1 电转化感受态的制作
• 2.2.11.2 重组质粒线性化
• 2.2.11.3 电转化
• 2.2.11.4 高拷贝转化子的筛选
• 2.2.12 SDS-PAGE
• 2.2.13 发酵产物的酶活测定
• 2.2.13.1 发酵产物的去离子
• 2.2.13.2 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.2.13.3 CMC 酶活力的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 纤维素酶基因克隆
• 3.1.1 里氏木霉基因组DNA 的提取
• 3.1.2 BGⅠ基因的克隆
• 3.1.3 CBHⅡ基因的克隆
• 3.1.4 EGⅡ基因的克隆
• 3.2 多克隆位点、G418 抗性基因及酿酒酵母RDNA 基因的克隆
• 3.2.1 多克隆位点的获得
• 3.2.2 G418 抗性基因的PCR 扩增和测序
• 3.2.3 酿酒酵母rDNA 基因的 PCR 扩增和测序
• 3.3 含纤维素酶基因的 PICHIA PASTORIS 表达载体构建
• 3.3.1 pPIC9K-BG、pPIC9K-CBH、pPIC9K-EG 的构建
• 3.3.2 pGAP9K-BG、pGAP9K-CBH、pG AP9K-EG 的构建
• 3.3.2.1 pGAP9K 的构建
• 3.3.2.2 pGAP9K-BG、pGAP9K-CBH、pG AP9K-EG 的构建
• 3.4 含纤维二糖水解酶基因的 PICHIA PASTORIS 工程菌构建
• 3.4.1 CBHⅡ基因转化毕节酵母 G5115
• 3.4.2 在G418 平板上筛选高拷贝整合cbh2 的重组转化子
• 3.5 在生物反应器中发酵 PICHIA PASTORIS 工程菌生产重组CBHⅡ
• 3.6 重组纤维素酶活力测定
• 3.6.1 反应体系中吸光度与葡萄糖含量的标准曲线
• 3.6.2 发酵液的酶活力
• 3.7 含纤维素酶系酿酒酵母表达载体构建
• 3.7.1 载体构建的流程图
• 3.7.2 载体构建过程中的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 关于材料的选择
• 4.2 关于外显子拼接法扩增目的基因
• 4.3 关于重组纤维素酶生产
• 4.4 关于载体的构建
• 4.5 关于用 G418 筛选高拷贝重组子
• 5 总结
• 参考文献
• 附录：缩写词（ABBREVIATION）
• 致谢