催乳素基因多态性及其与小尾寒羊高繁殖力相关性的研究

论文摘要

本研究以小尾寒羊（142只）、湖羊（40只）、特克塞尔羊（36只）、多赛特羊（36只）和考力代羊（28只）这五个绵羊品种为实验材料，应用PCR-SSCP对PRL基因的DNA编码序列的多态性进行了分析，并进一步对该基因与小尾寒羊高繁殖力之间的关系进行了研究。结果表明：5个绵羊品种在引物2的扩增产物中均存在单核苷酸多态性，其中只有多赛特羊未检测出DD型，而其余4个绵羊品种均检测出CC、CD和DD型。小尾寒羊、特克塞尔羊、多赛特羊和考力代羊这四个绵羊品种在其他四个引物扩增产物中均未检测到单核苷酸多态性。然而，只有湖羊的5对引物的PCR扩增产物在整个DNA编码序列中均检测到多态性。克隆测序后连接出绵羊PRL基因DNA编码序列的总长度为926bp，与牛的PRL基因DNA全序列（登录号：AF426315）相应区域的同源性高达98.25％，与NCBI上公布的绵羊的PRL基因mRNA（登录号：NM 001009306）的同源性高达98％（野生型）、97％（突变型）。绵羊PRL基因野生型和突变型的DNA编码区的同源性为98.7％（914／926），该编码区一共编码240个氨基酸，野生型和突变型之间的氨基酸同源性为98.75％（237╱240）。在整个催乳素基因的DNA编码区，经检测野生型和突变型一共存在12处碱基突变，但是只有3个突变为有义突变，所导致的氨基酸突变分别为：第27位氨基酸发生了从Leu到Pro的突变，第149位氨基酸发生了Ala到Val的突变，第206位氨基酸发生了Tyr到His的突变。对五个品种具有多态性的引物的扩增片段进行x2适合性检验，结果表明：引物2扩增片段在特克塞尔羊群体中的分布显著地偏离了Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），而在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊和考力代羊中都保持了Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。对有产羔记录的小尾寒羊群体的引物2扩增产物的突变位点与它的产羔数进行最小二乘分析，结果表明：CC型小尾寒羊平均产羔数分别比CD型和DD型多0.39只（P＜0.05）和0.98只（P＜0.05），CD型和DD型小尾寒羊平均产羔数差异不显著（P＞0.05）。C等位基因对D等位基因的显性度为0.20。结果显示，Leu到Pro的突变对小尾寒羊的产羔率有显著的影响。最终结果表明PRL基因的野生型（第27位氨基酸为Leu），编码的催乳素的表达水平可能较低，从而有助于提高小尾寒羊的产羔率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 绵羊繁殖力研究的相关情况
• 1.1.1 世界上的主要绵羊品种及部分产羔数
• 1.1.2 绵羊高繁殖力的研究进展
• 1.1.3 小尾寒羊的相关研究
• 1.2 催乳素的相关研究
• 1.2.1 催乳素的结构、功能及调控
• 1.2.2 催乳素基因的克隆与结构
• 1.2.3 催乳素基因的发育性表达
• 1.2.4 催乳素基因的定位及多态性
• 1.2.5 催乳素基因与生产性能的关系
• 1.3 主要实验方法的研究进展
• 1.3.1 Touchdown PCR
• 1.3.2 SSCP
• 2 本项研究的目的意义
• 3 实验材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验样本来源
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 溶液试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 样品的采集与保存
• 3.2.2 血液DNA的提取
• 3.2.3 DNA浓度和纯度的检测
• 3.2.4 引物设计
• 3.2.5 PCR反应
• 3.2.6 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行SSCP分析
• 3.2.7 聚丙烯酰胺凝胶的银染
• 3.2.8 基因型的判定
• 3.3 群体遗传学研究方法
• 3.3.1 基因频率
• 3.3.2 基因型频率
• 3.3.3 群体杂合度（Heterozygosity，H）
• 3.3.4 多态信息含量（PIC）
• 3.3.5 基因位点Hardy-Weinberg平衡状态的检验
• 3.3.6 PRL基因与小尾寒羊高繁殖力关系的研究
• 4 结果与分析
• 4.1 基因组DNA抽提结果
• 4.2 PCR产物的扩增结果
• 4.3 SSCP多态性检测结果
• 4.4 不同基因型个体的克隆测序结果及其多态性分析
• 4.5 PRL基因DNA编码区及氨基酸的结果分析
• 4.5.1 拼接PRL基因DNA编码区并进行氨基酸翻译
• 4.5.2 PRL基因氨基酸信号肤的确定
• 4.5.3 PRL基因编码区野生型和突变型的同源性分析
• 4.6 PRL基因在不同绵羊品种中的遗传多态性
• 4.6.1 PRL基因的基因频率和基因型频率分析
• 4.6.2 PRL基因引物2扩增产物的遗传特异性分析
• 4.6.3 湖羊的PRL基因5对引物的扩增产物的遗传特异性分析
• 4.6.4 Hardy-Weinberg平衡的检验
• 4.6.5 PRL基因引物2的PCR扩增产物不同基因型的小尾寒羊产羔数的最小二乘均值
• 5 讨论
• 5.1 影响PCR扩增反应的因素
• 5.1.1 模板的质量
• 5.1.2 引物的设计
• 5.1.3 PCR反应的温度
• 5.1.4 镁离子的浓度
• 5.2 影响SSCP检测的因素
• 5.2.1 PCR产物的质量
• 5.2.2 DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响
• 5.2.3 PCR片段的长度
• 5.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶成分
• 5.2.5 上样缓冲液与变性
• 5.2.6 电泳条件
• 5.2.7 其它因素
• 5.3 SSCP结果的分析
• 5.4 PRL基因测序结果讨论
• 5.4.1 PRL基因的DNA编码区与氨基酸序列的分析讨论
• 5.4.2 湖羊PRL基因的野生型与突变型与Soay绵羊的DNA同源性分析
• 5.4.3 湖羊PRL基因的野生型和突变型与Soay绵羊的氨基酸同源性分析
• 5.4.4 绵羊PRL基因5个外显子的粗略定位
• 5.5 PRL基因群体遗传特性的讨论
• 5.6 SSCP检测结果对小尾寒羊产羔数影响的讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文