橡胶树遗传转化的研究

论文摘要

巴西橡胶树是重要的经济树种,其独特的乳管结构和生产期长的特性,有可能发展成为一个高效、低成本的“植物生物反应器”,潜藏着巨大的商业开发价值。建立稳定、高效的橡胶树遗传转化体系,是将橡胶树发展成为“植物生物反应器”的关键步骤。因此,开展橡胶树遗传转化体系的研究具有重要的理论意义和巨大的应用前景。 本研究在综述橡胶树遗传转化体系、胚胎发生相关基因研究的基础上,以巴西橡胶树海垦2、热研88-13、热研7-33-97的花药为外植体,对愈伤组织的诱导条件、影响遗传转化的可能因素等进行了探讨,对利用胚胎发生相关基因提高橡胶树遗传转化效率的可能性等进行了研究,初步试验结果如下: 1、对以海垦2、热研88-13、热研7-33-97的花药为外植体诱导愈伤组织的最适变温温度和ABA浓度进行了研究,发现白天26℃、晚上25℃的变温、ABA为0.25mg/L时能够诱导出较高质量的花药愈伤组织。 2、以农杆菌浸染后愈伤组织的褐化程度为指标,发现最适于转化的愈伤组织为花药接种后25天左右,培养基的最适超纯琼脂粉为3g/L。通常使用的筛选抗生素Kan并不适合用于橡胶树花药愈伤组织转化的筛选。 3、根据文献报道的序列,从拟南芥基因组中成功克隆了胎胚发生关键基因PEI1基因的编码序列,构建了植物表达载体pBIP。将含有相应基因的植物表达载体pBIP（PEI基因）、pBIN（BnBBM1基因）和pBI121（GUS基因）直接导入农杆菌后,以接种后25天左右的花药愈伤组织为外植体,分别开展了橡胶树遗传转化的研究。 4、对抗性植株叶片和根部的组织化学检测结果表明,我们获得了1株Gus基因转基因植株;分子检测结果表明,我们获得了1株BnBBM1转基因植株,没有获得PEI1基因转化植株。这表明,在本试验中,胚胎发生相关基因BnBBM1和PEI1对遗传转化效率没有明显的影响。

论文目录

• 1 文献综述
• 1.1 巴西橡胶树遗传转化研究进展
• 1.1.1 巴西橡胶树遗传转化研究概况
• 1.1.2 巴西橡胶树高效遗传转化系统的影响因素
• 1.1.2.1 农杆菌菌株对转化和再生的影响
• 1.1.2.2 菌液浓度和外植体在菌液中的浸泡时间
• 2+对转化的影响'>1.1.2.3 Ca²⁺对转化的影响
• 1.2 橡胶树体细胞胚发生及影响因素
• 1.2.1 巴西橡胶树体细胞胚发生
• 1.2.1.1 体细胞发生概况
• 1.2.1.2 体细胞发生过程
• 1.2.1.2.1 愈伤组织的形成和发育
• 1.2.1.2.2 胚状体的形成和发育
• 1.2.2 巴西橡胶树体细胞发生的影响因素
• 1.2.2.1 植物基因型
• 1.2.2.2 外植体生理状态
• 1.2.2.3 外植体的预处理的影响
• 1.2.2.4 生长素和细胞分裂素
• 1.2.2.5 GA用量的影响
• 1.2.2.6 固化剂的影响
• 1.2.2.7 ABA的影响
• 1.2.2.8 多胺的影响
• 1.2.2.9 光照的影响
• 1.3 应用前景
• 1.3.1 快速繁殖优良无性系
• 1.3.2.基因转导
• 1.3.3 筛选突变体
• 1.3.4 原生质体培养
• 1.4 植物体细胞胚胎发生基因的研究
• 1.4.1 胚胎极性建立过程中的基因表达调控
• 1.4.2 形态建成过程中的基因表达调控
• 1.4.3 分生组织形成过程中的基因表达调控植物
• 1.4.4 胚体发育过程中的基因表达调控
• 1.5 本论文研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 PEI1基因的克隆与表达载体构建
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.1.1 拟南芥DNA
• 2.1.1.2 质粒与菌种
• 2.1.1.3 试剂及配制
• 2.1.1.3.1 所用试剂
• 2.1.1.3.2 试剂的配制
• 2.1.1.4 仪器设备
• 2.1.2 拟南芥基因组DNA的提取
• 2.1.3 引物设计与基因扩增
• 2.1.3.1 引物设计合成
• 2.1.3.2 PCR反应
• 2.1.3.3 PCR产物的电泳检测与回收
• 2.1.4 克隆与测序
• 2.1.4.1 连接与转化
• 2.1.4.2 重组克隆的筛选鉴定与保存
• 2.1.4.3 重组质粒DNA测序
• 2.1.5 植物表达载体的构建
• 2.1.5.1 材料与试剂
• 2.1.5.1.1 载体
• 2.1.5.1.2 菌株
• 2.1.5.1.3 试剂
• 2.1.5.2 表达载体的构建及鉴定
• 2.2 植物表达载体（BnBBM1）的鉴定
• 2.2.1 感受态E.coli DH5α的制备
• 2.2.2 表达载体转化E.coliDH5α感受态细胞
• 2.2.3 裂解法小量提取质粒
• 2.2.4 质粒的酶切鉴定
• 2.3 植物表达载体转化农杆菌
• 2.3.1 材料与试剂
• 2.3.1.1 载体
• 2.3.1.2 菌株
• 2.3.1.3 试剂及配制
• 2.3.2 表达载体转化农杆菌
• 2.4 BnBBM1、PEI1、Gus基因转化橡胶树
• 2.4.1 材料与试剂
• 2.4.1.1 植物材料
• 2.4.1.2 菌种
• 2.4.1.3 试剂、培养基及配制
• 2.4.1.3.1 试剂、培养基
• 2.4.1.3.1.1 试剂配制
• 2.4.1.3.1.2 培养基
• 2.4.2 花药培养及抗性选择实验
• 2.4.3 农杆菌对花药愈伤组织的转化
• 2.4.3.1 农杆菌菌液的制备
• 2.4.3.2 浸染与共培养
• 2.4.4 选择培养与检测
• 2.4.5 试验处理
• 2.4.5.1 三个橡胶树品种
• 2.4.5.2 取材时间
• 2.4.5.3 花药培养温度
• 2.4.5.4 浸染时期
• 2.4.5.5 共培养时间与菌液浓度
• 2.4.5.6 加As的时间及浓度
• 2.4.5.7 phytagel浓度
• 2.4.5.8 Kan浓度
• 2.4.5.9 ABA浓度
• 2.4.6 转基因植株的分子检测
• 2.4.6.1 CTAB法提取橡胶树DNA
• 2.4.6.2 PCR电泳检测
• 3 结果与分析
• 3.1 影响橡胶树遗传转化频率的几个因素
• 3.1.1 不同品种对遗传转化的再生频率影响
• 3.1.2 不同取材时期对转化后的再生频率差异
• 3.1.3 外植体生理状态对转化后再生频率的影响
• 3.1.4 温度对转化后再生频率的影响
• 3.1.5 共培养时间与菌液浓度对再生频率的影响
• 3.1.6 加As时间和浓度对愈伤组织转化的影响
• 3.1.7 超纯琼脂粉浓度的影响
• 3.1.8 Kan浓度的影响
• 3.1.9 ABA浓度的影响
• 3.2 农杆菌转化结果
• 4 讨论
• 4.1 橡胶树遗传转化中存在的问题
• 4.1.1 橡胶树的遗传转化方法单一
• 4.1.2 橡胶树遗传转化的受体较单一
• 4.1.3 对农杆菌介导的橡胶树遗传转化机理还缺乏系统而深入的研究
• 4.1.4 对橡胶树体外细胞胚发生机制缺乏系统的研究
• 4.1.5 瞬时表达效率和外植体生长矛盾
• 4.2 提高转化效率的途径
• 4.2.1 受体系统的完善
• 4.2.2 转化后恢复培养
• 4.2.3 抗性愈伤的筛选
• 4.2.4 提高抗性愈伤出苗率的措施
• 4.2.5 农杆菌与基因枪法的结合
• 5 结论
• 参考文献
• 附图
• 缩略语表
• 致谢