论文题目: 花生凝集素介导的结肠癌靶向给药系统的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 药剂学
作者: 蔡勤
导师: 张志荣
关键词: 氟尿嘧啶,花生凝集素,氟尿嘧啶花生凝集素偶联物
文献来源: 四川大学
发表年度: 2005
论文摘要: 结肠癌是胃肠道常见肿瘤。放疗对结肠癌敏感性较差及小肠毒副作用明显。常规化疗时,由于抗肿瘤药物通常缺乏区分正常细胞和恶性肿瘤细胞的选择性,容易引起全身的毒副作用、降低患者对治疗的耐受性。肿瘤靶向治疗有望将抗肿瘤药物选择性地集中在肿瘤组织,而没有临床上区域动脉灌注所带来的手术痛苦和风险,因而是较好的替代方法。目前,肿瘤靶向治疗最大的障碍是缺乏合适的具有特殊识别能力的药物载体。寻找选择性强、能够有效载带抗肿瘤药物的靶向载体,并考察其在体内的靶向性及在肿瘤模型中的活性,是靶向治疗研究中的热点领域。 近年来,凝集素在肿瘤研究中的应用受到了越来越广泛的关注。人体细胞膜含有丰富的糖蛋白和糖脂,其中糖类部分的单糖和寡糖可与凝集素发生特异性的亲和结合,不同细胞的受体由于所含糖的结构不同,只能与特定的凝集素结合,从而使凝集素具有“识别”某种细胞的能力。而且,某些肿瘤细胞存在着特异性的凝集素受体。此外,凝集素无免疫源性、与单糖及糖复合物中的糖结构部分的识别具有高度特异性、具有多价结合能力并且结合了某些药物、毒性蛋白、放射性同位素后其活性保持不变。因此,凝集素在肿瘤的靶向治疗中有着极好的应用前景。将抗肿瘤药物与凝集素偶联,选择合适的凝集素或许可以控制细胞对偶联物的摄取和其在细胞内的传递途径,从而实现肿瘤治疗真正意义上的细胞靶向。但目前,有关其在肿瘤靶向治疗中的作用的研究尚在起步阶段。 花生凝集素(PNA)是从花生中提取并纯化的一种蛋白质,具有如下主要特点:1)不凝集正常的淋巴细胞和血液细胞,如红细胞、白细胞;2)花生凝集素是种子植物的组成成分,亦是人常常食用的营养物质,无明显毒副作用;3)对酸性环境和多种酶有较好抗性;4)具有多价结合能力;5)结直肠肿瘤细胞上PNA受体与正常组织之间存在显著性差异,在大量癌变的结肠上皮细胞的细胞膜上和细胞的顶端胞浆内出现了PNA结合位点。以上特点说明PNA具有作为抗肿瘤药物载体用于肿瘤靶向治疗的可能性。 本课题选择治疗胃肠道肿瘤的一线药物5—氟尿嘧啶(5-Fu)作为模型药物,以在胃肠道肿瘤有高表达受体的花生凝集素为靶向载体,通过EDC/NHS一步法制备出可口服给药的5-Fu-PNA前体偶联物。综合考察了该偶联物的制备工艺、特异单糖对凝集素生物活性的保护作用和体外稳定性以及偶联物的电泳性质。采用流式细胞仪和荧光显微镜,以人结肠癌细胞LoVo和人正常肝细胞Chang作为代表性细胞模型,通过模型细胞荧光强度的变化对偶联物的细胞作用机制进行探
论文目录:
目录
中文摘要
ABSTRACT
前言
参考文献
第一部分 5-氟尿嘧啶-花生凝集素偶联物的制备
概述
实验方法和结果
一、主要试剂、设备与动物
1． 主要试剂
2． 设备
3． 动物
二、方法与结果
1． 5-氟尿嘧啶衍生物:1-N-乙酸-5-氟尿嘧啶的合成
1．1 1-N-乙酸-5-氟尿嘧啶的合成
1．2 1-N-乙酸-5-氟尿嘧啶的结构鉴定
1．2 1 UV光谱鉴定
1．2．2 ~1H-MR鉴定
1．3 讨论
2 PNA稳定性考察
2．1 PNA活性体外检测方法
2．2 PNA的温度稳定性
2．3 PNA的酸碱稳定性
2．4 讨论
3． 偶联物5-Fu-PNA的制备
3．1 5-Fu-PNA偶联物制备路线
3．2 5-Fu-PNA偶联物制备
3．3 偶联物的UV鉴定
3．4 药物结合率的测定
3．4．1 蛋白质含量的测量
3．4．1．1 Folin试剂的配制
3．4．1．2 标准曲线的建立
3．4．1．3 偶联物中蛋白质含量的测量
3．4．2 药物结合率测定方法(TNBS法)的建立
3．4．2．1 氨基酸和蛋白质TNP衍生物的光谱学特征
3．4．2．2 反应温度和时间的影响
3．4．3 药物结合率的测定
3．5 讨论
4． 偶联物制备条件的优化
4．1 反应物分子摩尔比的选择
4．2 连接反应时间的影响
4．3 D-半乳糖保护试验
4．4 讨论
三、小结
参考文献
第二部分 偶联物性质研究
概述
实验方法
一、主要试剂、设备与动物
二、实验方法与结果
1． 偶联物垂直板 SDS-PAGE电泳
2． 不同储存条件下偶连物的活性保留情况观察
3 偶连物在人工肠液和人工胃液中的稳定性观察
三、讨论
四、结论
参考文献
第三部分 偶连物与细胞的相互作用
概述
实验方法与结果
一、仪器、试剂与细胞系
1． 仪器
2． 试剂
二、方法与结果
1． 5-Fu-FITC-PNA复合物的制备与药物结合率的测定
2 LoVo和Chang细胞培养
3 偶连物与结肠癌细胞LoVo和正常人肝细胞Chang的相互作用
3．1 D-半乳糖和5-Fu-F-PNA偶连物无菌溶液的配制
3．2 5-Fu-FITC-PNA结合位点的饱和分析
3．3 偶连物与结肠癌细胞LoVo结合的特异性
3．4 温度对偶连物与结肠癌细胞LoVo结合的影响
4． 讨论
三、结论
参考文献
第四部分 5-Fu-PNA偶连物的细胞毒作用
概述
实验方法与结果
一、仪器、试剂与细胞系
1． 仪器
2． 试剂
3． 细胞系
二、方法与结果
1． LoVo生长曲线的测定
1．1 LoVo细胞培养
1．2 不同接种量LoVo细胞生长曲线的测定
1．3 测定方法
1．4 LoVo细胞生长曲线测定结果结果
1．4．1 不同接种量LoVo细胞生长曲线测定结果
1．4．2 与OD值呈线性相关的细胞接种范围
1．5 讨论
2． 5-Fu和5-Fu-PNA对结肠癌细胞LoVo的细胞毒作用
2．1 5-Fu和活性5-Fu-PNA偶连物无菌溶液的配制
2．2 固定培养时间时5-Fu和5-Fu-PNA抑制结肠癌细胞LoVo的量-效关系
2．3 固定给药浓度时二者抑制结肠癌细胞LoVo生长的时-效关系
2．4 系列浓度连续培养时，二者对LoVo的细胞毒作用
2．5 讨论
3 5-Fu-PNA对LoVo细胞毒作用的特异性
3．1 PNA、无活性偶连物和活性偶连物的无菌溶液配制
3．2 活性偶连物5-Fu-PNA对LoVo细胞毒作用的特异性
3．3 无活性偶连物和活性偶连物对LoVo细胞毒作用的时-效关系
3．4 讨论
4． 5-Fu-PNA细胞毒作用的选择性
4．1 5-Fu-PNA的选择性细胞毒作用
4．2 讨论
三、结论
参考文献
全文结论
致谢
植物凝集素的应用研究进展
参考文献
简历
声明
发布时间: 2005-11-09
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