酵母蛋白酶A抑制剂的研究

论文摘要

蛋白酶A(PrA)抑制剂在食品、医药、农业等领域有非常广泛的应用前景。本论文利用酵母中分离得到的PrA从灵芝发酵全粉中筛选到一种PrA抑制剂,并对该抑制剂的基本性质作了初步研究。论文不仅改进了PrA的分离纯化方案,而且建立了通过固定化PrA亲和层析筛选PrA抑制剂的高效方法,主要研究结果如下:1.改进了酵母PrA的分离纯化方案:以疏水层析代替原方案的离子交换层析,得到的PrA比活为12.6μ/mg,纯化倍数为25.2。改进方案后,在酶活和收率差别不大的情况下缩短了纯化周期。2.灵芝发酵全粉的抽提液经过分级醇沉,Ultrogel AcA44分子筛层析和Source Q强阴离子交换层析,得到一种PrA的抑制剂GLPAI,此抑制剂对PrA的抑制率高达75%。3.GLPAI的分子量大约为37000,其中蛋白质和糖的含量相对较高。GLPAI的热稳定性比较好,经过100℃的水浴处理后,对PrA的抑制率仍稳定在70%;GLPAI对PrA的最佳反应pH、最佳反应时间分别为3.5～5.5和1小时。GLPAI对胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶都有一定的抑制作用。4.GLPAI的动力学研究结果表明:GLPAI对胃蛋白酶的Ki=4.64(μmol/L),抑制类型为非竞争和反竞争性混合抑制作用;对胰蛋白酶的Ki=33.5(μmol/L),抑制类型为竞争和非竞争性混合抑制作用;对PrA的Ki=2.7(μmol/L),抑制类型为竞争和非竞争性混合抑制作用。5.固定化PrA反应的最佳条件为:反应pH为4.0,戊二醛终浓度为0.6%,给酶量为40mg/0.2g壳聚糖。在此条件下,固定化酶的回收率为45.9%。6.以固定化PrA为固定相,灵芝发酵全粉抽提液为流动相,通过一步亲和层析提取到PrA抑制剂。此抑制剂分子量为34000,与GLPAI相近,而且其中蛋白质与糖的含量的比例与GLPAI的相近,因此可以推断通过亲和层析提取到的PrA抑制剂和GLPAI可能是同一物质。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 立题意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 酵母PrA 的研究
• 1.2.2 PrA 抑制剂的研究
• 1.3 本论文研究内容
• 第二章 酵母PRA 的分离纯化
• 2.1 材料及方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 改进前分离纯化PrA 方案
• 2.2.2 改进方法后疏水层析结果
• 2.2.3 PrA 分离纯化方法改进前后的比较
• 2.3 本章小结
• 第三章 PRA 抑制剂（GLPAI）的提取
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 乙醇分级沉淀各部分对PrA 抑制效果检测
• 3.2.2 Ultrogel AcA44 分子筛层析
• 3.2.3 Source Q 强阴离子交换层析
• 3.3 本章小结
• 第四章 GLPAI 的性质研究
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 GLPAI 基本性质的研究
• 4.2.2 GLPAI 的特异性研究
• 4.2.3 GLPAI 的抑制动力学性质研究
• 4.3 本章小结
• 第五章 PRA 抑制剂高效筛选方法的研究
• 5.1 实验材料及方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验器材
• 5.1.3 实验方法
• 5.2 实验结果与讨论
• 5.2.1 固定化PrA 条件优化
• 5.2.2 固定化酶亲合层析提取PrA 抑制剂条件的研究
• 5.2.3 Ultrogel AcA44 分子筛层析测定B 的分子量
• 5.3 本章小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢