论文摘要
目的αvβ3整合素受体过表达于肿瘤血管内皮细胞,在肿瘤血管生成中发挥重要作用,可被视为肿瘤特异性标记物。通过对该受体的特异性标记,有望早期、特异性诊断肿瘤。本研究合成表面连接RGD短肽序列为亲和成分的靶向性超顺磁性长循环脂质体,并通过体外细胞学实验、体内MRI成像确定其受体靶向性,探讨早期肿瘤血管靶向性诊断的可能性。材料与方法我们采用薄膜法分别合成表面连接和不连接RGD的靶向性和非靶向性长循环脂质体,其内水相分别包裹超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Superparamagnetic IronOxide,SPIO）和钙黄绿素。测量其包封率、粒径大小、弛预率,透射电镜观察SPIO包封情况。靶向性研究部分采用流式细胞分析及共聚焦激光扫描显微镜观察。人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）培养及传代,制备细胞悬液备用。将细胞分为四组:一组加入靶向性长循环荧光脂质体（实验组）;一组加入非靶向性长循环荧光脂质体（对照组）;空白对照组仅加入PBS缓冲液;竞争实验部分,先给予过量RGD（约10倍浓度）,然后加入靶向性长循环脂质体。反应约1小时后,用流式细胞仪测量阳性细胞百分比、几何平均荧光强度等。共聚焦激光扫描显微镜实验部分。HUVEC置于预先放有盖玻片的六孔细胞培养皿中过夜,细胞爬片备用。载有细胞的盖玻片分别与靶向性、非靶向性长循环荧光脂质体反应约1小时,反应分别在4℃、37℃下进行。反应结束后,经洗涤、固定后,共聚焦显微镜观察细胞荧光标记情况。所有实验过程中注意避光。随后进行兔Vx2肿瘤模型体内MRI成像研究。于双侧兔后腿皮下建立荷瘤模型,分别经耳缘静脉注入靶向性超顺磁性长循环脂质体、非靶向性超顺磁性长循环脂质体,铁含量约3mg/kg。进行MRI扫描,测量给药前、给药后不同时间段肿瘤及周边肌肉信号变化情况,计算对比噪声比。实验结束后处死动物,肿瘤标本进行HE、普鲁士蓝染色,光镜观察,确定靶向性造影剂中铁的分布与肿瘤血管的关系。所得数据以均数±标准差的形式表示,行单因素方差分析,以p≦0.05为有统计学意义。p≦0.01为有显著统计学意义。结果靶向性超顺磁性长循环脂质体、非靶向性超顺磁性长循环脂质体的粒径分别为144、147nm,两者粒径分布均匀。靶向性脂质体的磁性粒子包封率为0.27mg/mL,普通长循环脂质体为0.28mg/mL。RGD短肽与脂质体的偶连率为74.97%。靶向性脂质体的弛预率为1769 mM-1s-1,非靶向脂质体的弛预率为1356mM-1s-1。超顺磁性长循环脂质体可以显著缩短质子的T2弛预时间（P＜0.001）。透射电镜证实铁颗粒包封在脂质体内。流式细胞研究结果表明靶向组、非靶向组、竞争组及空白对照组细胞阳性率平均分别为76.15%、10.81%、18.96%及0.37%,靶向组明显高于其他各组（P≦0.002）。几何均数荧光强度靶向组（128.71）也远高于非靶向组（36.71）及竞争实验组（39.78）（P＜0.001）。竞争实验组细胞阳性率、荧光强度与非靶向组接近。共聚焦研究靶向组可见明显细胞染色,4℃时荧光染色位于细胞膜,37℃荧光染色主要位于细胞质。非靶向组细胞在4℃、37℃均未见明显染色。体内MRI成像显示靶向组于肿瘤周边及血管周边可见信号减低,信号改变发生较慢,15小时后信号降至最低（P＜0.05）,随后开始升高;非靶向组给药后很快出现信号减低,至2小时降至最低（P＜0.05）,随后信号开始逐渐升高。肿瘤对比噪声比也表现为这一规律。肌肉信号变化不明显,无统计学意义（P＞0.05）。离体标本普鲁士蓝染色观察,靶向组铁颗粒位于肿瘤血管周边,部分位于肿瘤血管内皮;非靶向组铁颗粒主要位于肿瘤间质,分布弥漫,与肿瘤血管关系不密切。结论本研究结果证实RGD—超顺磁性长循环脂质体具有较高的弛预率,能与αvβ3整合素受体特异性结合,在肿瘤特异性浓聚,并能够用MRI扫描进行证实。