无选择标记基因的抗虫转基因植物研究

论文摘要

目前，几乎所有的植物遗传转化都要使用选择标记基因，诸如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子，虽然仍无直接研究结果表明选择标记基因影响人类健康或环境安全，但近年来人们对转基因产品安全性的担心却与日俱增。为了消除转基因食品的安全性顾虑，无选择标记转基因植物应运而生。结球甘蓝在我国蔬菜周年供应中占有重要地位。菜青虫、小菜蛾等害虫是甘蓝生产的主要障碍之一，常造成甘监的大幅度减产或品质下降。但迄今为止，通过常规育种方法选育抗虫的蔬菜新品种尚未取得重大进展，鉴于基因工程在农作物品种改良方面取得的巨大成功，通过转基因途径向甘蓝等蔬菜导入抗虫基因成为大家关注的焦点。大豆kunitz蛋白酶抑制剂（SKTI）是一种主要存在于大豆种子中的蛋白酶抑制剂。通常认为这种蛋白酶抑制剂的生理功能是作为储藏蛋白，调节内源蛋白酶的活性，以及保护种子不受昆虫和病原菌的侵害等，是一种天然的抗虫物质。更为重要的是，现已证实蛋白酶抑制剂转入食用作物中，对人畜没有副作用。因此，将该蛋白酶抑制剂作为抗虫目的基因并结合无选择标记转基因技术获得的抗虫转基因甘蓝将有利于消费者的接受。 本研究采用目前在植物抗虫基因工程中广泛使用的大豆胰蛋白酶抑制剂（SKTI）基因为抗虫目标基因，除草剂基因Bar基因作为筛选标记基因，为了便于Bar基因的剔除，在构建连锁表达载体的同时，将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点间。将含Cre基因的植物表达载体plus-cre，对得到的抗虫植株进行二次转化，将重组酶基因Cre引入；或单独转化烟草、甘蓝，在开花时通过有性杂交的手段将重组酶基因引入而实现Bar基因剔除的目的。存在于植株中的Cre基因及相应的筛选标记可通过花期自交分离的方法去除，最终获得仅含抗虫目的基因的转基因植株。主要研究结果包括以下几个方面： 1．甘蓝高频再生—转化体系的建立 甘蓝（铁头金刚）种子在无菌操作台内播种于1/2MS固体培养基中发芽，以发芽6～7d（依具体发芽情况而定）的下胚轴为外植体，MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA（0.1～0.2mg/L）与BA（1.0～3.0mg/L）的激素组合，筛选芽分化的最佳培养基。结果表明：

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 无选择标记转基因植物的研究进展
• 1.2 去除选择标记基因的意义
• 1.3 无选择标记转基因植株的获得
• 1.3.1 共转化法
• 1.3.2 转座子法
• 1.3.3 位点特异性重组系统法
• 1.4 植物蛋白酶抑制剂基因的研究进展
• 1.4.1 植物蛋白酶抑制剂的分类
• 1.4.2 植物蛋白酶抑制剂的抗虫性研究
• 1.4.3 植物蛋白酶抑制剂的作用机理
• 1.4.4 植物蛋白酶抑制剂的调控
• 1.4.5 蛋白酶抑制剂在抗虫基因工程中存在的问题
• 1.4.6 转基因植物抗虫性表达的增强
• 第二章 引言
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究的内容
• 2.3 论文新意
• 第三章 实验材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌种、质粒和试剂
• 3.1.3 植物总DNA提取缓冲液
• 3.1.4 细菌培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 大豆DNA的提取及PCR扩增
• 3.2.2 PCR扩增产物的克隆
• 3.2.3 质粒转化大肠杆菌
• 3.2.4 SKTI基因测序及序列分析
• 3.2.5 抗虫基因（SKTI）与 Bar基因连锁表达载体的构建
• 3.2.6 质粒PCABarSKTI转化农杆菌
• 3.2.7 SKTI抗虫基因转化烟草及转基因烟草的PCR检测
• 3.2.8 重组酶基因（Cre）二次转化烟草及检测
• 3.2.9 甘蓝再生-转化体系的建立
• 3.2.10 SKTI抗虫基因转化甘蓝及转基因植株的检测
• 3.2.11 重组酶基因Cre转化甘蓝及其检测
• 第四章 结果与分析
• 4.1 大豆DNA的提取及PCR扩增
• 4.2 PCR产物的克隆及酶切检测
• 4.3 SKTI基因的测序与序列分析
• 4.4 抗虫表达载体的构建及酶切检测
• 4.5 SKTI转基因烟草的获得及PCR检测
• 4.6 无选择标记基因（Bar）抗虫烟草的获得及检测
• 4.6.1 重组酶基因（Cre）二次转化抗虫烟草及PCR检测
• 4.6.2 Cre二次转化抗虫烟草的Bar基因删除检测
• 4.7 甘蓝再生-转化体系的建立
• 4.7.1 不同甘蓝品种发芽率、外植体再生情况的比较
• 4.7.2 不同外植体芽分化能力的比较
• 4.7.3 不同BA与NAA浓度组合对甘蓝下胚轴芽分化的影响
• 4.7.4 遗传转化中的筛选剂
• 4.8 SKTI抗虫转基因甘蓝植株的获得及检测
• 4.8.1 SKTI抗虫基因转化甘蓝
• 4.8.2 SKTI抗虫转基因甘蓝植株的pCR检测
• 4.8.3 SKTI抗虫转基因甘蓝的抗除草剂检测
• 4.8.4 SKTI抗虫转基因甘蓝的抗虫试验
• 4.9 重组酶Cre转基因甘蓝植株的获得及检测
• 第五章 讨论
• 5.1 大豆胰蛋白酶抑制剂类型
• 5.2 大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因差异表达与基因克隆
• 5.3 SKTI抗虫转基因甘蓝的离体抗虫试验
• 5.4 甘蓝遗传转化中的筛选问题
• 5.5 转基因植株中选择标记基因的删除问题
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文及参加课题
• 缩写词