转录因子AP-2α靶基因ZNF256的克隆及其功能研究

论文摘要

MAPK是一族胞浆内广泛分布的蛋白激酶,包括细胞外调节蛋白激酶（Extracellular-Signal Regulated Kinase ERK）、p38-MAPK、C-junN端激酶（JNK）。在细胞的增殖、分化和生存中起着重要作用,而转录因子AP-2家族目前有五个成员被鉴定出来AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ和AP-2ε。现在研究表明,在胚胎发生时期转录因子AP-2与细胞增长、组织分化、肿瘤的形成和迁移有关。染色质免疫共沉淀技术发现AP-2α能够和ZNF256内含子DNA片段相互作用,并且电泳凝胶迁移变动分析法找到AP-2α合位点。荧光定量PCR实验和萤光素酶实验表明AP-2α能够增强ZNF256的转录活性。萤光素酶实验证明AP-2α能够增强ZNF256对AP1和SRE的抑制活性。这些结果表明AP-2α能够结合基因ZNF256而且影响其转录活性。ZNF256基因定位于19q13.43区域,全长673个氨基酸,含有典型KRAB和锌指结构域,属于C2H2型锌指蛋白,目前还没有关于该基因功能的报道。生物信息学预测ZNF256基因参与了MAPK信号通路,与此同时研究发现19q13.43区域含有一个锌指蛋白簇,该蛋白簇中的锌指蛋白大部分可以抑制AP1和SRE的转录活性。这与我们的实验结果相符ZNF256基因可以抑制AP1和SRE的转录活性并且在转录因子AP-2α存在的情况下这种抑制作用明显加强。这暗示AP-2α可能与MAPK信号通路有关,这些结果为深入研究MAPK信号通路复杂的传递机制提供了新的依据。

论文目录

• 英文缩写表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 锌指蛋白简介
• 1.1 锌指蛋白基因家族
• 1.2 锌指蛋白基因的结构和功能
• 2 MAPK 信号通路简介
• 2.1 MAPK 家族
• 2.2 MAPK 的特异性激活机制
• 2.3 MAPK 信号途径的功能
• 3 AP-2家族的简介
• 3.1 AP-2的定位及其功能
• 第一部分 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌种和细胞株
• 1.2 载体和工具酶
• 1.3 抗体
• 1.4 试剂盒
• 1.5 其它试剂
• 1.6 所需溶液
• 1.7 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 CHIP 技术分析 AP-2α和 DNA 相互作用片段
• 2.2 细胞培养
• 2.3 萤光素酶实验验证 AP-2结合 DNA 片段
• 2.4 凝胶电泳迁移率实验（EMSA）
• 2.5 Real-time PCR
• 2.6 萤光素酶实验验证 AP-2α能够影响 MAPK
• 2.7 对 ZNF256的初步研究
• 第二部分 结果分析
• 1 CHIP 技术分析 AP-2α相互作用 DNA 片段
• 2 AP-2α结合 DNA 片段的分析和验证
• 2.1 萤光素酶实验检测 AP-2α结合区域
• 2.2 确定 DNA 片段中 AP-2α结合位点
• 2.3 凝胶电泳迁移率实验确定 AP-2α结合位点
• 3 AP-2α调控 ZNF256表达
• 4 AP-2α与 MAPK 信号通路
• 4.1 ZNF256是转录抑制因子
• 4.2 ZNF256抑制 AP1、SRE
• 4.3 AP-2可能增强 ZNF256对 AP1、SRE 的抑制
• 5 ZNF256的初步研究
• 5.1 ZNF256各种细胞和组织表达谱的鉴定
• 5.2 ZNF256的亚细胞定位
• 第三部分 讨论
• 参考文献
• 附录:攻读硕士学位期间发表的学术论文目录
• 致谢