人工合成寡核苷酸的液相色谱—质谱研究

论文题目: 人工合成寡核苷酸的液相色谱—质谱研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 环境科学

作者: 陈华勇

导师: 傅家谟,盛国英,周振

关键词: 分型,甲基化,飞行时间质谱仪

文献来源: 中国科学院研究生院（广州地球化学研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: SNP分型和DNA甲基化在分子生物学中具有重要的研究意义，但它们传统的分析方法存在较大的缺陷，而液-质联用技术在SNP分型和DNA甲基化分析中显示出良好的应用前景。目前，应用液-质联用仪，特别是串级质谱研究SNP分型和DNA甲基化鲜有报道，正处于起步阶段。因此，本文将应用高效液相色谱—串级质谱联用仪(HPLC-MS／MS)对人工合成寡核苷酸(ODNs)和甲基化修饰寡核苷酸样品进行研究，初步建立ODNs测序和甲基化定位的质谱分析方法。本研究可以为DNA加合物的质谱分析奠定基础，具有一定探索性，难度也较大。主要研究内容如下：1．应用RP-IP-HPLC对ODNs混合片段的分离，从片段长度、碱基组成、末位碱基差异、片段内二级结构以及不同流动相系统等方面讨论了它们对ODNs片段在RP-IP-HPLC中保留行为的影响。2．应用HPLC-MS／MS快速确定ODNs的分子量，并在合适条件下进行串级质谱分析得到片段序列信息，总结ODNs单级质谱和串级质谱分析的普遍规律。3．应用HPLC-MS／MS对两组SNP分型寡核苷酸进行分析。4．应用HPLC-MS／MS对甲基化寡核苷酸进行分析。5．此外，还对自制高分辨飞行时间质谱仪(TOFMS)进行了调试，并应用TOFMS分析ODNs。通过上述5个方面的研究，得出了以下结论：1．在RP-IP-HPLC中，片段长度越短、片段(G+C)％越大的片段越早洗脱；室温下仅末尾碱基不同的四种ODNs的洗脱顺序为G＜C＜T＜A；在TEAA流动相系统中，具有二级结构的ODNs较不具二级结构的ODNs先洗脱；TEAA和TEAB流动相系统中ODNs洗脱顺序基本相同，主要受(G+C)％和片段长度的影响，而在TEA-HFIP中ODNs的洗脱顺序主要受片段长度的影响，受(G+C)％的影响相对较小；此外，梯度洗脱时有机相梯度越大分离速度越快，分离分辨率越低。2．在HPLC-MS／MS中，ODNs母离子TIC强度主要受片段碱基组成、不同流动相系统、以及仪器参数(如CUR、IS等)影响；ODNs母离子电荷态分布主要受仪器DP值、不同流动相系统、片段长度以及进样方式的影响；ODNs子离子谱图主要受碰撞能和电荷态的影响。碰撞能越大，碎片离子越多，碎片离子m／z分布越窄；在得到相似碎片离子谱图时，高电荷态较低电荷态需较少的碰撞。3．应用HPLC-MS／MS不仅能快速鉴定SNP分型类别，而且可通过测序快速确定位于片段前端或后端的SNP位点。4．应用HPLC-MS／MS可快速定量甲基化率，并且可通过测序确定甲基化位点。T-rich片段中碱基C被m~5C替换时，只使片段在HPLC中的保留时间增加，而不改变片段在MS／MS中的破碎规律。不同电荷态下片段在MS／MS中的破碎规律不同，低电荷态下有利于快速确定甲基化位点。5．自制高分辨TOFMS调试结果显示其具有优越的性能，已成功测试了脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

第一节 色谱法简介

1.1 色谱法及其特点

1.2 色谱法的发展

第二节 质谱法简介

2.1 质谱法及其特点

2.2 质谱法的发展

第三节 选题依据

3.1 研究背景

3.2 立题依据

3.2.1 串级质谱分析寡核苷酸的优势

3.2.2 串级质谱分析单核苷酸多态性分型的优势

3.2.3 串级质谱分析DNA甲基化的优势

3.3 主要研究内容

第二章 RP-IP-HPLC分离寡核苷酸

第一节 实验部分

1.1 实验材料

1.2 实验方法

第二节 结果与讨论

2.1 片段长度的影响

2.2 片段(G+C)%的影响

2.3 末位碱基的影响

2.4 片段二级结构的影响

2.5 流动相系统的影响

2.5.1 有机相梯度的影响

2.5.2 流动相系统种类的影响

第三节 小结

第三章 HPLC-MS/MS分析寡核苷酸

第一节 实验部分

1.1 实验材料

1.2 仪器介绍

1.3 实验方法

第二节 HPLC-MS分析ODNs

2.1 影响TIC强度的因素

2.1.1 ODNs碱基组成

2.1.2 流动相系统种类

2.1.3 喷雾电压和布帘气流量

2.2 影响母离子电荷态分布特征的因素

2.2.1 DP的影响

2.2.2 流动相系统种类

2.2.3 片段长度

2.2.4 是否过色谱柱

第三节 MS/MS分析ODNs

3.1 流动相系统种类对ODNs子离子谱图的影响

3.2 电荷态和碰撞能对ODNs子离子谱图的影响

第四节 小结

第四章 HPLC-MS/MS在SNP分型和DNA甲基化分析中的应用

第一节 HPLC-MS/MS分析SNP分型

1.1 HPLC-MS鉴定SNP分型

1.2 MS/MS分析SNP分型

第二节 HPLC-MS/MS分析DNA甲基化

2.1 HPLC-MS定量DNA甲基化率

2.2 MS/MS鉴定DNA甲基化位点

第三节 小结

第五章 自制高分辨TOFMS及其在寡核苷酸分析中的应用

第一节 TOFMS原理及其发展简介

1.1 TOFMS原理

1.2 TOFMS国外研究现状

1.3 TOFMS国内研究现状

第二节 自制高分辨ESI-TOFMS性能调试

2.1 质量测量范围

2.2 质量分辨率

2.3 测量绝对灵敏度

2.4 质量测定精度

第三节 自制高分辨TOFMS分析寡核苷酸

第四节 小结

第六章 论文主要结论、创新点与不足之处

参考文献

索引

致谢

博士期间(待)发表论文

发布时间: 2007-08-02

参考文献

• [1].生物大分子结构单元——碱基与活性无机小分子作用的理论研究[D]. 张士国.山西大学2005
• [2].单个碱基对的热力学与动力学[D]. 王宇杰.武汉大学2016
• [3].金属离子与DNA碱基对相互作用的理论研究[D]. 张愚.华中科技大学2008

相关论文

• [1].寡核苷酸的生物质谱研究[D]. 杨何义.中国人民解放军军事医学科学院2003
• [2].基于液相色谱—电喷雾质谱联用技术的中药物质基础辨识方法研究[D]. 张海江.浙江大学2004
• [3].电喷雾质谱及其联用技术在药物分析中的应用[D]. 周慧.浙江大学2005
• [4].多维液相色谱-质谱联用技术在蛋白质组学中的应用[D]. 靳文海.中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）2005
• [5].蛋白质组研究中多维液相色谱—质谱技术平台的建立及其应用[D]. 张养军.中国人民解放军军事医学科学院2003
• [6].生物质谱新技术与新方法及其在蛋白质组学中的应用研究[D]. 贾韦韬.复旦大学2006
• [7].蛋白质组学多维色谱质谱分析平台新技术新方法研究[D]. 张婕.复旦大学2006
• [8].液相色谱—质谱联用方法的研究及其在蛋白质组分析中的应用[D]. 周虎.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2007
• [9].液相色谱—质谱联用在食品和临床检测中的应用研究[D]. 喻凌寒.中国科学院研究生院（广州地球化学研究所）2007
• [10].多维液相色谱质谱联用技术及其在人类肝脏蛋白质组学研究中的应用[D]. 陈明.中国人民解放军军事医学科学院2007

标签：分型论文;  甲基化论文;  飞行时间质谱仪论文;