苹果Ty1-copia类逆转座子的特性及其在苹果属遗传多样性分析中的应用

论文题目: 苹果Ty1-copia类逆转座子的特性及其在苹果属遗传多样性分析中的应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 孙俊

导师: 章镇

关键词: 苹果,类逆转座子,多样性,甲基化,转录,遗传多样性

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 转座子是真核生物基因组内重要组成成分之一，可以从一个位点转移至另一个位点并能产生一系列变异的遗传因子。根据转座方式的不同，转座子通常被分为两类：一类是以RNA为中介进行转座的逆转座子，另一类是直接以DNA到DNA的方式进行的转座子。逆转座子是其中种类最多、分布最广的一类，其特殊的转座过程使其引起的突变为稳定突变，Ty1-copia类逆转座子是植物中研究的较为深入的一类。已有研究表明Ty1-copia类逆转座子对植物基因组大小、结构、基因功能以及基因和基因组进化等都有重要影响。苹果（Malus×domestica Borka．）是世界范围内广泛栽培的果树，但目前关于苹果基因组内Ty1-copia类逆转座子的研究却很少。本试验研究了苹果基因组内Ty1-copia类逆转座子在苹果属中存在的普遍性、多样性、甲基化水平、在基因组中的作用、转录活性、以及LTRs的特性，并利用基于LTRs的SSAP技术研究了苹果属部分野生种与栽培种的遗传多样性和芽变的分子机理。1、优化了苹果Ty1-copia类逆转座子逆转录酶保守片段的PCR反应体系：Mg2+浓度为5mmol／L；dNTP浓度200μmol／L；引物浓度为0.5μmol／L；Taq聚合酶浓度为50μl反应体系中为1U。从苹果属12个野生种和苹果23个栽培品种中都扩增到了约270bp的目的产物，且所有试材的扩增结果一致，均无目的条带以外的产物扩增，说明Ty1-copia类逆转座子在苹果属植物中广泛存在，且存在历史可能较为久远；从扩增结果看不出该逆转座子的逆转录酶基因或附近区域在苹果基因组内有嵌套行为的发生。2、利用优化了的PCR方法从嘎拉苹果基因组克隆了45条Ty1-copia类逆转座子逆转录酶保守序列（登陆号分别为AY849580-AY849592和DQ105035-DQ105066），结果表明，同一基因组来源的这些序列存在高度的异质性。核甘酸序列长度变化范围为196bp-279bp，同源性为40％-99.2％，氨基酸序列同源性为31.3％-100％，其中有11条序列发生了移框突变，13条序列含有1-3个不等的终止密码子突变，22条序列在保守片段SLYGLKQ处发生了碱基替代突变，3条序列发生重组突变，至少有5条序列发生了碱基缺失突变，1条序列发生了插入突变。根据氨基酸序列的同源性将来自于同一祖先的45条序列对应的逆转座子分为10个家族，其中家族1-7中序列总数约占克隆总数的93％，存在有转座活性的逆转座子的可能性较大；家族8-10各只含有一条序列。比较苹果与其它物种中Tyl-copia类逆转座子逆转录酶基因保守片段同源性，发现苹果与挪威云杉、番茄和马铃薯中存在相似性很高的Tyl-copia类逆转座子。3、本试验以从嘎拉苹果基因组获得的Tyl-copia类逆转座子逆转录酶基因的总的保守序列为探针，以田间植株、组织培养植株和转基因植株的不同酶切产物为模板进行Southern杂交，结果表明苹果基因组内Tyl-copia类逆转座子拷贝数高；基因组内部分Tyl-copia类逆转座子被甲基化，这不仅在一定程度上维护了寄主基因的功能和基因组的稳定性，而且促进了寄主基因型多样性的发展与基因组进化；上述三种材料不同酶切产物的杂交信号及强度没有区别。4、研究了愈伤组织培养条件下苹果基因组内Tyl-copia类逆转座子的转录活性。在培养基MS+2，4-D 2mg／L+BA 0.2mg／L+NAA 0.5mg／L上诱导了1个月的愈伤组织呈现非正常生长状态、无再生迹象。以Tyl-copia类逆转座子逆转录酶区域的兼并引物进行RT-PCR，检测到了270bp的目的条带，而对照、继代组培苗和不含2，4-D诱导的愈伤组织及幼芽中均无该条带的扩增，说明2mg／L的2，4-D能诱导Tyl-copia类逆转座子转录活性的表达。将目的条带回收、克隆和测序后进行分析，所有序列都属于Tyl-copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸保守序列。21条序列（登陆号分别为AY849591-AY849596和DQ105060-DQ105074）的变异性较大，核甘酸序列长度从196-277bp，同源性45.3％-99.6％；推断其氨基酸序列变异范围为36.8％-98.9％，其中有2条序列发生了移框突变，4条序列含有终止密码子突变，9条序列在保守片段SLYGLKQ处发生了碱基替代突变，2条序列发生重组突变，至少有1条序列发生了缺失突变，1条序列发生了插入突变。比较21条序列之间以及与其它物种中同类序列的相似性，发现21条序列被聚为五类，其中，第一类与甜菜、第二类与日本樱花和挪威云杉、第四类与拟南芥中含有相似性高的Tyl-copia类逆转座子。尤其是第二类的prt52与日本樱花中BAA02268.1的同源性高达91.6％。5、本文采用改进过的Pearce等方法获得了苹果Tyl-copia类逆转座子的RNase-LTR序列。所分离的20条序列的长度变化范围107-500bp；根据Tyl-copia类逆转座子的特征推断出的PPTs和IR中，有9条序列的PPTs全由嘌呤碱基构成，11条序列的PPTs中有1个嘧啶碱基的替代突变；19条序列的IR为“TG”，一条序列因重组而缺失；20条序列中有4条序列出现重组现象，重组率是20％。根据RNase氨基酸序列的同源性，20条序列可分为六类，每一类中各序列长度、组成、RNaseH的结构、PPTs的结构及起始位置等并不完全相同。在每一类中都有RNaseH核甘酸序列同源性达90％以上的序列存在，说明这些逆转座子的转座活性可能一直伴随着苹果基因组的进化历程，这增强了苹果基因组的可塑性。分析获得的Tyl-copia类逆转座子的LTRs，其中含有启动子的结构特征“CAAT box”和“TATA box”及受不同胁迫条件作用的调控元件。6、基于苹果Tyl-copia类逆转座子LTR-10的SSAP技术在苹果属8个野生种和28个栽培品种中表现出了丰富的遗传多态性，多态性片段比例为88.2％。所有供试材料被聚为三组，第一组全由国外引入的栽培种质构成；第二组由野生种质组成；槟子因其遗传背景复杂，被单独聚为第三组，第二、第三组种质都原产于中国。其中，具有相同或相近起源的种质多数能被聚在一起，说明基于Tyl-copia类逆转座子的分子标记在研究物种的遗传多样性上具有很大的发挥潜力。此外，在红星的芽变品种矮威尔中检测到了一条约180bp的特异带，表明该品种的芽变与逆转座子的插入突变可能有一定关系。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

缩略词

引言

第一章 文献综述——植物逆转座子研究进展

1 植物逆转座子的类型与结构

1.1 LTR逆转座子中的Ty1-copia型

1.2 LTR逆转座子中的Ty3-gypsy型

1.3 non-LTR逆转座子中的长散在元件LINE

1.4 non-LTR逆转座子中的短散在元件SINE

2 植物中逆转座子的复制与转座

2.1 LTR逆转座子的复制

2.2 Non-LTR逆转座子的复制

3 植物逆转座子的分布

3.1 逆转座子在植物界的分布

3.2 逆转座子在细胞器中的分布

3.3 逆转座子在染色体上的分布

4 逆转座子的异质性

5 逆转座子的纵、横向传递

5.1 逆转座子的纵向传递

5.2 逆转座子的横向传递

6.逆转座子的表达与转座的调控

6.1 胁迫表达

6.2 基因沉默

6.3 转录后调控

7 逆转座子的起源与进化

8 逆转座子在植物基因与基因组进化中的作用

8.1 基因突变

8.2 基因组大小

8.3 基因组重排

8.4 其它作用

9 逆转座子的应用

9.1 基于逆转座子的分子标记与应用

9.1.1 基于逆转座子的分子标记

9.1.2 逆转座子分子标记的应用

9.2 基因标签及基因功能分析

9.3 体细胞无性系变异的评价

10 展望

参考文献

第二章 苹果属植物基因组中Ty1-copia类逆转座子存在的普遍性

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备

1.2.2 DNA的检测与定量

1.2.3 PCR反应

1.2.4 PCR产物的检测

2 结果与分析

2.1 苹果Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列PCR反应体系的建立

2.1.1 Mg~(2+)浓度对扩增结果的影响

2.1.2 dNTP浓度对扩增结果的影响

2.1.3 引物浓度对扩增结果的影响

2.1.4 Taq聚合酶浓度对扩增结果的影响

2.1.5 不同复性温度对扩增结果的影响

2.2 苹果属中Ty1-copia类逆转座子存在的普遍性

3 讨论

参考文献

第三章 苹果基因组中Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的多样性

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备

1.2.2 DNA的检测与定量

1.2.3 PCR反应

1.2.4 PCR产物的检测与回收

1.2.5 回收片段的检测及与PGEM-T-Easy体(Promega)的连接

1.2.6 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备

1.2.7 质粒的转化

1.2.8 质粒的提取

1.2.9 质粒的检测

1.2.10 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶保守序列的测序

1.2.11 序列分析

2 结果与分析

2.1 PCR产物的回收与克隆

2.2 重组质粒的PCR鉴定

2.3 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的核甘酸序列比较

2.3.1 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核甘酸序列的异质性

2.3.2 苹果Ty1-copia类逆转座子的序列重组

2.4 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸序列比较

2.4.1 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列的BLAST结果

2.4.2 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列的多样性

2.4.3 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列的聚类分析

2.4.4 苹果与其它植物中Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列的同源性比

3 讨论

3.1 苹果中Ty1-copia类逆转座子的多样性

3.2 苹果基因组内Ty1-copia类逆转座子间的重组

3.3 Ty1-copia类逆转座子在苹果基因组进化中的作用

参考文献

第四章 苹果基因组中Ty1-copia类逆转座子的甲基化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

1.2.2 DNA的检测与定量

1.2.3 探针的制备及标记

1.2.4 DNA的酶切

1.2.5 电泳

1.2.6 转膜及洗膜

1.2.7 预杂交及杂交

1.2.8 洗膜

1.2.9 免疫检测

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的质量检测

2.2 基因组DNA的酶切

2.3 Southern-blot杂交

3.讨论

参考文献

第五章 苹果愈伤组织培养过程中Ty1-copia类逆转座子的转录活性

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 总RNA的制备

1.2.2 RT-PCR

1.2.3 RT-PCR产物的回收、克隆、PCR检测与测序

1.2.4 序列分析

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的生长状况

2.2 总RNA的提取与检测

2.3 Ty1-copia类逆转座子转录活性的诱导

2.4 苹果中具有转录活性的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核甘酸序列的分析

2.4.1 苹果中具有转录活性的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核甘酸序列的异质性

2.4.2 具有转录活性的Ty1-copia类逆转座子的序列重组

2.5 具有转录活性的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸序列比较

2.5.1 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列的BLAST结果

2.5.2 具有转录活性的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列的多样性

2.5.3 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列的聚类分析

3 讨论

3.1 苹果中Ty1-copia类逆转座子的转录活性

3.2 苹果中具有转录活性的Ty1-copia类逆转座子的变异性

参考文献

第六章 苹果Ty1-copia类逆转座子RNase-LTR序列的克隆与分析

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备、检测与定量

1.2.2 模板DNA的部分酶切

1.2.3 Mse Ⅰ-adaptor的变性与退火

1.2.4 连接反应

1.2.5 连接反应产物的回收与纯化

1.2.6 连接产物的PCR扩增

1.2.7 PCR产物的回收与纯化

1.2.8 Biotin连接产物的亲和捕捉与纯化

1.2.9 以Biotin连接产物为模板的Nested-PCR

1.2.10 Nested-PCR产物的回收与纯化

1.2.11 Nested-PCR纯化产物与PGEM-T-Easy载体(Promega)的连接

1.2.12 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备及质粒的转化

1.2.13 阳性克隆的检测与测序

1.2.14 序列分析

2 结果与分析

2.1 基因组DNA模板的制备及酶切

2.2 连接产物的纯化及PCR

2.3 生物素连接产物的回收、亲和纯化与Nested PCR

2.4 苹果中Ty1-copia类逆转座子PPTs和IR的特性

2.5 RNaseH-LTRs序列的异质性

2.6 Ty1-copia类逆转座子及其LTR序列间的重组

2.7 Ty1-copia类逆转座子LTR序列中的启动子结构与调控元件

3 讨论

3.1 苹果中Ty1-copia类逆转座子LTRs

3.2 Ty1-copia类逆转座子的转座活性与基因组的可塑性

3.3 Ty1-copia类逆转座子LTRs内的启动子结构与调控元件

参考文献

第七章 苹果属遗传多样性的SSAP分析

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备

1.2.2 DNA的检测与定量

1.2.3 基因组DNA的酶切

1.2.4 Mse Ⅰ-adaptor的变性与退火

1.2.5 连接反应

1.2.6 预扩增

1.2.7 选择性扩增

1.2.8 扩增产物的检测

1.2.9 聚类分析

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的制备

2.2 逆转座子在苹果基因组插入位点的多态性

2.3 聚类分析

2.4 逆转座子在苹果芽变品种间的差异

3 讨论

参考文献

全文讨论

1 苹果中Ty1-copia类逆转座子的多样性及潜在的转座活性

2 逆转座子的诱导表达及其对寄主基因表达的影响

3 逆转座子在苹果遗传多样性及基因组进化中的作用

参考文献

全文结论

创新点

附录

附图1

附图2

附录1

攻读博士期间发表论文

致谢

发布时间: 2006-10-20

参考文献

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• [3].果梅LTR类逆转座子序列特征及遗传多样性的SSAP分析[D]. 王飞.南京农业大学2010

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• [7].新疆野苹果（Malus sieversii（Ledeb.）Roem.）部分表型性状遗传多样性研究[D]. 冯涛.山东农业大学2007
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标签：苹果论文;  类逆转座子论文;  多样性论文;  甲基化论文;  转录论文;  遗传多样性论文;