固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的制备及动力学拆分DL-苯丙氨酸类化合物的研究

论文摘要

青霉素G酰化酶广泛应用于半合成p-内酰胺抗生素的酶法合成。粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶（Alcaligenes faecalis, Af-PGA）因其稳定性好等优点受到关注。本论文以Af-PGA为对象,考察其提取、固定化及在手性拆分中的应用,主要做了以下三个部分的工作：第一部分,重组Af-PGA的提取方法研究：向20%（w/v）的菌体悬浮液中加入乙酸丁酯使其终浓度达到5%,在25℃下处理36 h,在不破碎细胞的前提下,Af-PGA的提取率达到92%以上,所获得Af-PGA粗酶液的比活14.45 IU/mg。第二部分,Af-PGA的固定化及性质研究：以氨基和环氧基载体作为固定化的载体材料,通过固定化条件的优化,使两种载体固定化酶的活力均高于商品化酶IPA750。酶学性质研究表明这两种载体固定化酶的最适温度均为65℃,最适pH均为8,热稳定性和pH稳定性都优于游离酶。第三部分,固定化Af-PGA（EP2）酰化拆分外消旋苯丙氨酸及其衍生物：在投酶量为1 IU/ml,DL-苯丙氨酸和苯乙酰胺初始浓度分别为0.1 M和0.25 M,pH 10,温度35℃下反应,通过结晶法分离产物D-苯丙氨酸,对映体过量率为97.6%,得率65.2%,拆分结果优于现有的文献报道。在相同条件下拆分了5种苯丙氨酸对位取代衍生物,均取得了较好的结果,其中吸电子基团取代的苯丙氨酸拆分结果好于未取代的,给电子基团取代效果最差。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 青霉素酰化酶简介
• 1.1.1 青霉素酰化酶的来源
• 1.1.2 粪产碱杆菌青霉素酰化酶简介
• 1.2 青霉素酰化酶的抽提研究
• 1.2.1 常用细胞破碎方法简介
• 1.2.2 化学渗透法提取青霉素酰化酶的研究进展
• 1.3 青霉素酰化酶的共价载体固定化研究
• 1.3.1 酶的共价固定化法简介
• 1.3.2 青霉素酰化酶的共价固定化研究进展
• 1.4 青霉素酰化酶在手性拆分中的应用
• 1.4.1 通过水解反应拆分外消旋化合物
• 1.4.2 通过酰化反应拆分外消旋化合物
• 1.5 本论文的研究内容、目的与意义
• 第2章 粪产碱杆菌来源青霉素酰化酶（Af-PGA）的抽提
• 2.1 前言
• 2.2 实验仪器与材料
• 2.2.1 主要材料试剂
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 Bradford法测定蛋白浓度
• 2.3.2 酶活测定方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 超声破碎提取
• 2.4.2 冻融破碎抽提
• 2.4.3 渗透压冲击提取
• 2.4.4 高压匀浆破碎提取
• 2.4.5 化学渗透法提取
• 2.5 本章小结
• 第3章 粪产碱杆菌青霉素酰化酶的固定化
• 3.1 前言
• 3.2 实验仪器及材料
• 3.2.1 主要材料试剂
• 3.2.2 主要实验仪器
• 3.3 实验部分
• 3.3.1 载体活化
• 3.3.2 Af-PGA固定化
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 氨基载体固定化条件的优化
• 3.4.2 环氧载体固定化条件的优化
• 3.5 本章小结
• 第4章 载体固定化酶HA和EP2的酶学性质研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验仪器及材料
• 4.2.1 主要材料试剂
• 4.2.2 主要实验仪器
• 4.3 酶活力检测方法
• 4.3.1 滴定法检测PGA水解青霉素G钾盐的活力
• 4.3.2 HPLC法检测PGA水解青霉素G钾盐和头孢烷酸的活力
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 HA和EP2的最适温度
• 4.4.2 HA和EP2的最适pH
• 4.4.3 温度稳定性
• 4.4.4 pH稳定性
• 4.4.5 有机溶剂耐受性
• 4.4.6 最适青霉素G钾盐（PGK）底物浓度
• 4.4.7 最适头孢烷酸（CepG）底物浓度
• 4.4.8 不同固定化青霉素酰化酶对青霉素G钾盐和头孢烷酸的底物选择性
• 4.5 本章小结
• 第5章 环氧基载体固定化酶EP2的公斤级制备
• 5.1 前言
• 5.2 实验仪器及材料
• 5.2.1 主要材料试剂
• 5.2.2 主要实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 工艺流程图
• 5.3.2 实验步骤
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 各步骤酶活回收率的计算
• 5.4.2 生产1KG固定化酶所需要的物料核算
• 5.5 本章小结
• 第6章 EP2酰化拆分DL-α-苯丙氨酸及其对位取代衍生物
• 6.1 前言
• 6.2 实验仪器及材料
• 6.2.1 主要材料试剂
• 6.2.2 主要实验仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 HPLC检测方法的建立
• 6.3.2 拆分效果评价
• 6.3.3 Af-PGA酰化拆分苯丙氨酸的及其衍生物的方法
• 6.3.4 酰基供体的合成
• 6.4 实验结果与讨论
• 6.4.1 投酶量对酰化反应的影响
• 6.4.2 pH对酰化反应的影响
• 6.4.3 酰基供体浓度对酰化反应的影响
• 6.4.4 反应温度对酰化反应的影响
• 6.4.5 酰基供体类型对酰化反应的影响
• 6.4.6 苯乙酰胺酰化拆分DL-苯丙氨酸反应进程曲线的绘制
• 6.4.7 从反应体系中分离D-苯丙氨酸
• 6.4.8 EP2拆分对位取代的苯丙氨酸衍生物
• 6.5 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢