TvNHX1基因转化大豆及其耐盐性分析

论文摘要

盐胁迫是影响植物生长、降低农作物产量的主要逆境因素之一,提高作物的耐盐性已成为世界各国育种工作者研究的焦点。栽培大豆（Glycine max L.）属于中度耐盐植物,在我国有很大的种植面积。通过植物基因工程技术将耐盐基因导入大豆,培育耐盐大豆新品种,对我国农业的发展有重要的现实意义。本研究首先评价分析了4个不同大豆品种对NaCl胁迫的应答与响应。未胁迫条件下,耐盐性强的品种MDA含量和SOD活性显著高于耐盐性弱的品种;胁迫后,其MDA含量降低、SOD活性升高。MDA和SOD可以作为大豆耐盐性筛选指标。早期的短时胁迫对不同耐盐性大豆品种的经济产量影响不同。利用HindIII和EcoRI对PBI121-TvNHX1质粒进行双酶切,获得35S: TvNHX1 :NosT表达卡盒片段,将此片段连接到载体pCAMBIA3300中,经过菌落PCR及酶切鉴定,获得了重组质粒P33-TvNHX1,成功构建了TvNHX1基因的植物表达载体。将含有TvNHX1基因的表达载体P33-TvNHX1质粒,采用花粉管通道法转化大豆5个不同品种。大豆幼苗2片真叶展开后,将其中1片涂上0.03﹪浓度的Basta溶液,对部分转化株进行PPT抗性筛选,PCR扩增获得9株导入了TvNHX1基因的大豆植株,其中22293-1,1株、22021-1,2株、21216-6,3株、22451-1,1株、21066-2,2株。RT-PCR检测到转基因植株中TvNHX1基因表达。在300 mmol/L NaCl处理下,转TvNHX1基因植株根系与地上部的生长状况均明显好于对照,转TvNHX1基因植株耐盐性明显增强。表明TvNHX1基因可有效提高大豆对NaCl的耐受性。转空载体pCAMBIA3300基因的植株与非转基因大豆的表型相同,表明载体骨架对转化无影响。同时显示花粉管通道法介导的转化方法在提高大豆耐盐性基因工程中是一种可行的技术。对T2代转TvNHX1基因大豆植株进行PCR检测,从28株大豆中检测到20株TvNHX1阳性植株,表明TvNHX1基因在大豆后代中稳定遗传。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 植物的抗逆性
• 1.1.1 盐胁迫对植物的伤害
• 1.1.2 植物响应盐胁迫的机理
• 1.1.3 Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系
• 1.2 基因工程在大豆育种中的应用
• 1.3 花粉管通道理论基础及其可行性
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第2章 大豆不同品种耐盐性的评价
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试验试剂和主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 出苗期和苗期NaCl 胁迫及形态学性状的测定
• 2.2.2 出苗期和苗期生理指标的测定
• 2.2.3 成熟期农艺性状的测定
• 2.2.4 数据统计分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 大豆不同品种出苗期和苗期对NaCl 胁迫的响应
• 2.3.2 胁迫处理后大豆不同品种生理指标的变化
• 2.3.3 出苗期和苗期NaCl 胁迫对成熟期农艺性状的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 大豆耐盐性指标鉴定
• 2.4.2 大豆短时胁迫与产量的关系
• 2.4.3 生理指标测定的注意事项
• 2.5 本章小结
• 第3章 TvNHX1 基因植物表达载体的构建与鉴定
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 酶和主要生化试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 质粒提取液
• 3.1.5 主要仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 质粒DNA 的提取
• 3.2.2 TvNHX1 基因植物表达载体的构建与鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 TvNHX1 基因植物表达载体的构建及鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 载体系统的构建方案
• 3.4.2 核酸限制性内切酶酶切的注意事项
• 3.5 本章小结
• 第4章 TvNHX1 基因对大豆的转化及PPT 筛选
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 质粒
• 4.1.2 供试品种
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 质粒DNA 的提取
• 4.2.2 TvNHX1 基因的花粉管通道法转化大豆
• 4.2.3 播种转基因大豆
• 4.2.4 PPT 抗性筛选
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 供试大豆品种的基本特征
• 4.3.2 TvNHX1 基因对大豆转化
• 4.3.3 PPT 抗性筛选结果
• 4.3.4 转基因大豆与非转基因大豆成熟期比较
• 4.4 讨论
• 4.4.1 转基因大豆成熟期及产量
• 4.4.2 转化最佳时间
• 4.5 本章小结
• 1代分子检测'>第5章 转基因大豆T₁代分子检测
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 转基因植株基因组DNA 的提取
• 1 代的PCR 检测'>5.2.2 转基因大豆T₁ 代的PCR 检测
• 1 代RT-PCR 分析'>5.2.3 转基因大豆T₁ 代RT-PCR 分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 大豆基因组DNA 的提取结果
• 1 代的PCR 检测结果'>5.3.2 转基因大豆T₁ 代的PCR 检测结果
• 1 代RT-PCR 分析结果'>5.3.3 转基因大豆T₁ 代RT-PCR 分析结果
• 5.4 讨论
• 5.4.1 影响影响RT-PCR 的因素
• 5.4.2 转空载体pCAMBIA3300 基因作用
• 5.5 本章小结
• 2代对NaCl 的响应与分子检测'>第6章 转基因大豆T₂代对NaCl 的响应与分子检测
• 6.1 试验材料
• 6.1.1 植物材料
• 6.2 试验方法
• 2 代对NaCl 胁迫的响应'>6.2.1 转基因大豆T₂ 代对NaCl 胁迫的响应
• 6.2.2 转基因植株基因组DNA 的提取
• 2 代PCR 检测'>6.2.3 转基因大豆T₂ 代PCR 检测
• 6.3 结果与分析
• 2 代对NaCl 胁迫的应答'>6.3.1 转基因大豆T₂ 代对NaCl 胁迫的应答
• 2 代PCR 检测结果'>6.3.2 转基因大豆T₂ 代PCR 检测结果
• 6.4 讨论
• 6.4.1 盐胁迫对大豆植株的影响
• 6.4.2 转基因植株后代的遗传表现
• 6.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢